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水稻黄单胞Xanthomonas oryzae pv. oryzicola RS105 LPS合成基因簇的功能分析

龙菊英  
【摘要】:水稻白叶枯病菌Xanthimonas oryzae pv.oryzae(Xoo)和水稻细菌性条斑病菌Xanthimonas oryzae pv.oryzicola(Xooc)是水稻上的两个致病变种。Xoo在亚热带国家成为一个重要的病害,在一定的栽培和生长季节发生Xoo可以导致50%以上的损失。Xooc只分布在热带地区,亚洲包括孟加拉,柬埔寨,中国的福建、广东和海南,发生严重的水稻也会造成叶片枯死和产量损失。同时两个模式种菌株也是研究植物病害的重要模式菌株,对两个病原细菌致病机理的了解有利于提高病害防治水平或改进防止策略。由于Xoo和Xooc限制修饰系统阻止细菌接受外源DNA,对Xoo和Xooc进行的反向遗传学研究在很大程度上受到了限制,在一定程度上限制了我们对两病原细菌的致病分子机制的理解。本文通过反向遗传学研究初步论证了Xooc菌株RS105 LPS与致病性的关系,从研究手法和致病机理两个方面为理解Xooc和Xoo做了一点铺垫。 1 突变体的获得和阳性克隆的筛选 通过化学诱变获得来自于Xooc菌株RS105和Xoo菌株PXO99丧失胞外多糖(Exopolysaccharide)和在水稻上致病力(Pathogenicity)的突变体,表示为EPS~-Path~-。从RS105中得到6个突变体,分别是M12、M13、M17、M19、M21、M23;从PXO99中得到三个突变体K7、K21、K23。以M12为诱饵从2200个RS105的基因组文库中钓取一个阳性克隆P35,同时以K7为诱饵从2000个PXO99基因组文库中得到一个阳性克隆A286。 P35阳性克隆以KpnI和EcoRI完全消化产生的亚克隆不能够恢复M12的功能,KpnI不完全消化得到一个包含两个KpnI片段的克隆PK23恢复了突变体的表型,进一步BamHI亚克隆PK23(12.7kb)也不能够产生有功能的片段,而EcoRI不完全消化产生的6.78kb的亚克隆P80恢复了M12的功能。序列测定表明6.78kb片段中可能包含7个基因,分别有一个KpnI、EcoRI切割在ORF1内,但是包含ORF1的BamHI亚克隆片段也不能够恢复M12的功能,说明恢复M12的功能需要ORF1和包含BamHI位点的另外一个基因ORF2同时参与。通过亚克隆PCR分析产生的ORF1-ORF3,ORF3-ORF2以及用PCR产生的ORF1和ORF2的克隆都不能恢复M12的功能,而


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