收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

高效聚磷菌的筛选、ppk基因的克隆及其应用研究

蔡天明  
【摘要】: 水体富营养化是全球十大环境问题之一。氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。城镇生活污水的排放是水体磷污染的主要来源之一。为解决磷污染所带来的危害,在污水进入水体前进行有效处理,降低排放污水的磷浓度十分必要。目前世界各地大规模污水处理厂主要采用强化生物除磷工艺(EBPR),EBPR工艺具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特征。在EBPR系统中聚磷菌在磷的去除中起着至关重要的作用。但迄今为止,人们仅分离到Acinetobacter species、Microlunatus phosphorus Lampropedia spp.、Pseudomonas spp.等属的为数不多的PABs,而且这些菌纯培养时很少能表现出EBPR系统典型聚磷菌的厌氧特征,有关聚磷菌的工程化应用尚无报道;同时,由于微生物学家和工程专家结合不紧密,加之EBPR系统本身的复杂性,对EBPR的微生物学机理和分子机理了解不多,导致EBPR的稳定运行难以控制和整个生物聚磷研究进展不快。为此,加大聚磷菌的筛选力度,对聚磷菌的聚磷特性和聚磷关键基因,对聚磷菌的工程化应用进行研究十分必重要。 本文以高效聚磷菌聚磷机理研究为主线,从高效聚磷菌的筛选着手,系统研究了高效聚磷菌的生物学特性、聚磷特性、与聚磷相关的ppk基因、高效菌株GM6的定殖及其强化废水生物除磷能力探索了GM6的工程化应用前景,构建了国内生物除磷研究的技术平台,取得了目前国内污水强化生物除磷基础研究和应用领域较为丰富的研究成果。 一.聚磷菌的筛选及生物学特性 改进了高效聚磷菌的筛选方法,筛选出了四株聚磷能力远高于国外报道的野生菌株聚磷水平的高效聚磷株:采取大通量高流量的原则,采用平板梯度稀释涂布、poly-P和PHB染色和蓝白斑筛选获得初选聚磷菌25株;经好氧和厌氧培养确定了四株高效聚磷菌GM1、GM6、GM18和GM21,选择GM1和GM6作为研究材料。经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析和同源性比较,GM1被初步鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii);GM6被初步鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。 GM1在合成废水中生长时,最适初始pH为7.0,最适生长温度为30℃,当初始pH值大于8.5或小于5.5时或当温度小于5℃或大于33℃时生长较慢;GM6在合成废水中培养时,最适起始pH为6.5,最适生长温度为27℃,当初始pH值大于8.0或小于5.0时,或当温度小于5℃或大于37℃时生长较慢;装液量对GM1和GM6生长影响不大。 二.GM1和GM6的聚磷特性 GM1和GM6纯培养时表现出了典型PABs的特征,为生物除磷研究提供了宝贵的材料:GM1和GM6在合成废水中培养时,除磷最适初始pH值分别为6.5和7.0,当pH值小于5.5或大于7.5时,除磷能力均下降。GM1和GM6的最适除磷温度为20℃和27℃;当温度大于30℃或小于10℃时,GM1除磷效果明显变差;当温度大于33℃或小于5℃时,GM6的除磷效果明显变差。GM1和GM6对合成废水、MOPS培养基、LB培养基及YG培养基的好氧磷去除率分别在60%-89.6%和63%-96.6%之间(对照菌E.coli的去除率在13.6%-30.8%之间)。GM6的聚磷和放磷能力更强。当以乙酸为底物好氧培养时:GM1和GM6体内能聚集类脂粒PHB,菌体PHB浓度上升与乙酸的浓度下降呈负相关;GM1、GM6厌氧培养时,底物乙酸浓度下降与菌体PHB的上升和磷浓度的增加呈负相关;在起始1h内乙酸的吸收及磷的释放速度较快,随着乙酸的吸收和poly-P的分解,上清液中乙酸浓度下降,磷的浓度上升,两者呈负相关。 三.GM6(Pseudomonas putida)多聚磷酸盐激酶基因ppk的克隆及表达 国内首次克隆了聚磷菌的ppk基因,对ppk基因进行了表达,表达菌株的除磷效率较高。本研究根据ppk基因的保守区设计引物,从GM6的总DNA中扩增到ppk基因的528bp的片段,随后采用一种新型的扩增未知序列的PCR技术SEFA-PCR扩增片段的上下游基因序列,将扩增的片段和扩增的上下游序列进行拼接,用Omiga软件进行开放阅读框分析,预测ppk基因全长为2220bp。其上游为HemB基因,长度可能为1119bp。将GM6的ppk基因序列与其它已报道的ppk基因进行同源性比较,GM6与Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas syringae、Klebsiella aerogenes、Neisseria meningitidis、Acinetobacter sp.ADP1和Escherichia coli K12-MG1655在核对苷酸水平的同源性分别为82%、79%、84%、45%、63%、53%和22%;与Pseudomonas putida KT2440、Acinetobacter.sp.ADP1、Escherichia coli K12-MG1655、Neisseria meningitidis MC58和Pseudomonas aeruginosa PAO1在氨基酸水平的同源性分别为89%、58%、33%、50%和80%。 构建的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET29a-ppk经IPTG诱导3h时,获得了ppk基因的表达产物,其分子量约81 kDa。表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET29a-ppk 12h的磷去除率高达80%(而对照菌株磷去除率仅为18%),远高于国外报道的40%的磷去除率。表明ppk基因在E.coli中的过量表达,导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集,从而使得培养基中的磷酸盐大量的去除。 四.高效聚磷菌GM6在活性污泥中的定殖及强化生物除磷应用研究 首次将高效菌株进行了工程应用,获得了快速强化废水生物除磷的能力。利用三亲接合对高效聚磷菌GM6进行标记,获得gfp基因标记菌株GMTR。试验表明,应在厌氧起始时投加菌株,当接种量小于1%时,GMTR投菌后难以获得生长优势;接种量达到2%时,在装置运行12个循环后,按2%-7.5%四种不同的接种比例投菌时污泥中GMTR的比例相差不大。因此,实际投菌时,确定比例为2%。GMTR在R2中的定殖情况是:在R2的污泥中检出了GMTR,而对照R1污泥中在抗性平板上培养时末检出。投加GMTR至R2后,R2运行21d时,GMTR的比例升至9.2%,GMTR的菌数已占据优势。投加GMTR菌株后,磷的去除率逐渐提高,运行21d时磷的去除率升至96%,28d后出水浓度稳定在0.2 mg L~(-1)左右。运行21d时,装置R2的厌氧和好氧污泥具备了EBPR的典型特征,厌氧1h,能快速放磷除有机物,好氧2h能有效除磷。因此,投加GM6能快速启动和恢复强化生物除磷能力。选择除磷能力较差的生活污水处理设施,利用GM6来强化其除磷能力,按2%比例投菌,投菌6d后,出水磷浓度逐渐下降,至25d时,出水磷浓度小于0.5 mg L~(-1),磷的去除率达96.8%。因此,GM6强化生物除磷效果显著。 五.影响EBPR系统生物除磷的主要因素 研究了进水乙酸浓度、厌氧生境、进水pH、好氧溶氧浓度及污泥泥龄对EBPR系统除磷效果的影响。厌氧45min时,释磷量随着进水中乙酸比例增加逐渐增大,仅以葡萄糖为碳源时释磷量仅为2.25 mg L~(-1),乙酸比例为15%时释磷量为16.69 mg L~(-1),乙酸比例大于30%时释磷量基本不变;厌氧120min时,进水乙酸比例对于磷释放量影响不大。过高的厌氧搅拌转速对厌氧释磷有影响,当转速过高时磷释放量下降。对系统释磷而言,最适pH6.5,当进水pH大于7.0或小于6.0时,磷释放量均下降,当pH大于7.5时,磷的释放量大幅下降。对系统磷去除率而言,进水最适pH为6.5,当进水pH超过7.0时,系统对磷的去除效率迅速下降,当pH值为8.0时的磷去除率仅为39.7%,系统失去了强化生物除磷能力。曝气强度对出水中COD_(Cr)浓度的影响较小,但其对出水磷浓度影响较大,当曝气强度使DO达到2.10 mg L~(-1)时,出水磷浓度下降到0.26mg L~(-1)的水平。污泥泥龄对系统的除磷效果影响较大,当污泥泥龄为4d时,出水磷和COD_(Cr)的浓度分别为0.25 mg L~(-1)和25 mg L~(-1),MLVSS值为2.97 mg L~(-1),厌氧磷的释放量为33.8 mg L~(-1),污泥的磷含量为6.36%,EBPR系统处于良好运行状态。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 任世英,肖天;聚磷菌体内多聚物的染色方法[J];海洋科学;2005年01期
2 李捷,熊必永,张杰;电子受体对厌氧/好氧反应器聚磷菌吸磷的影响[J];哈尔滨工业大学学报;2005年05期
3 汤桂兰;花日茂;孙振钧;王健;;高效聚磷菌的诱变选育及特性研究[J];激光生物学报;2006年04期
4 魏新全;王宏成;;强化生物除磷工艺中聚磷菌和聚糖菌竞争影响因素的研究进展[J];中国西部科技;2011年08期
5 任世英;王子峰;肖天;Serge Nitsche;;一株海洋聚磷菌YSR-3的分离与鉴定[J];海洋与湖沼;2006年05期
6 任世英;张宇红;张武昌;肖天;;海洋聚磷菌Halomonas YSR-3的除磷特性研究[J];高技术通讯;2008年07期
7 马民;陈银广;顾国维;;污水处理过程中聚糖菌的富集培养[J];环境科学与技术;2006年06期
8 任世英;肖天;;海洋聚磷菌中核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析[J];海洋科学;2008年09期
9 张敬;任丽平;陈金华;;聚磷菌AP7的筛选及除磷特性研究[J];中国西部科技;2011年15期
10 徐伟锋;顾国维;张芳;;生物除磷系统中聚糖菌代谢机理的研究进展[J];微生物学通报;2006年04期
11 傅宏兵;吴涓;;两株高效聚磷菌的筛选及其聚磷特性的研究[J];生物学杂志;2009年06期
12 亢涵;王秀蘅;李楠;;FISH技术在强化生物除磷中的应用[J];生物技术;2007年04期
13 张超;陈银广;;增强生物除磷系统中微生物及其代谢机制研究进展[J];环境科学与技术;2010年10期
14 王锐萍;邢雪忠;李干容;;高效嗜热聚磷菌的构建[J];生物技术;2006年04期
15 陈亚松;金文标;闫韫;赵勇娇;;高效聚磷菌的筛选及其应用[J];净水技术;2011年02期
16 东野脉兴,樊竹青,张灼,夏学惠,田升平,周建民;滇池微生物解磷与聚磷作用的实验研究及磷的现代沉积与微生物成矿作用[J];吉林大学学报(地球科学版);2003年03期
17 东野脉兴,樊竹青,张灼,夏学惠,田升平,周建民;云南滇池微生物对磷循环与沉积作用的实验研究[J];化工矿产地质;2003年02期
18 周小红;陈洪斌;何群彪;;除磷微生物和新型除磷工艺[J];四川环境;2006年04期
19 汤桂兰;花日茂;孙振钧;吴祥为;;聚磷菌的诱变选育及其生长特性[J];生物技术;2006年02期
20 由阳;袁志国;李夕耀;彭永臻;;强化生物除磷系统中主要菌群的富集和培养[J];高技术通讯;2009年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 连丽丽;朱昌雄;;约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)CH-1的分离及其聚磷特性的研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
2 张超;陈银广;;混合酸对增强生物除磷系统厌氧代谢的影响[A];第五届全国环境化学大会摘要集[C];2009年
3 焦中志;李相昆;张利成;张杰;;反硝化聚磷菌种的反硝化吸磷特性研究[A];首届沂蒙科技论坛论文集[C];2008年
4 唐艳葵;童张法;张寒冰;王孝英;;厌氧/缺氧条件下DNPAO_s同步硝化/反硝化脱氮除磷的实验研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2006年
5 邱慎初;;生物除磷系统中一个尚未明确的问题——厌氧稳定[A];中国土木工程学会水工业分会第四届理事会第一次会议论文集[C];2002年
6 东野脉兴;夏学惠;周建民;田升平;张灼;樊竹青;;滇池磷的现代沉积与环境[A];“十五”重要地质科技成果暨重大找矿成果交流会材料二——“十五”地质行业获奖成果资料汇编[C];2006年
7 李辉;祁佩时;王化可;马晓春;毕孟飞;;A~2/O工艺中的矛盾关系及其改进[A];第七届全国磷化学化工暨第四届海峡化学生物学、生物技术与医药发展讨论会论文集[C];2006年
8 吴若愚;李勇;陈宇;;改进A~2/O工艺的研究现状与进展[A];中国环境科学学会2009年学术年会论文集(第二卷)[C];2009年
9 杨柳燕;赵庆顺;王勤;肖琳;蒋丽娟;尹大强;;聚磷激酶的克隆和在大肠杆菌中表达研究[A];江苏省遗传学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年
10 谢琴;孙力平;苏晓;;厌氧/好氧SBR系统中碳源对除磷效果的影响[A];2008年全国给水排水技术交流会暨全国水网理事会换届大会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 任世英;海洋聚磷菌Halomonas YSR-3的除磷特性研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2008年
2 王锐刚;活性污泥法除磷动力学研究[D];中国矿业大学;2009年
3 石玉明;A~2SBR反硝化除磷工艺效能及微生物生理生态特征研究[D];哈尔滨工业大学;2009年
4 叶姜瑜;SUFR系统中微生物多样性及稳定性的试验研究[D];重庆大学;2007年
5 由阳;EBPR系统中聚磷菌与聚糖菌的竞争和调控的基础研究[D];哈尔滨工业大学;2008年
6 高志广;城市污水脱氮除磷过程模拟及工艺优化运行研究[D];同济大学;2007年
7 黄宇;颗粒污泥用于污水生物除磷及剩余污泥中磷回收技术研究[D];天津大学;2010年
8 罗宁;双泥生物反硝化吸磷脱氮系统工艺的试验研究[D];重庆大学;2003年
9 李楠;SBR系统在低温条件下的废水生物除磷性能及除磷途径分析[D];哈尔滨工业大学;2010年
10 李楠;SBR系统在低温条件下的废水生物除磷性能及除磷途径分析[D];哈尔滨工业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘菡;土壤中聚磷菌的聚磷特性研究[D];吉林农业大学;2013年
2 刘爱军;富营养化湖泊沉积物中聚磷菌的分离筛选及特性研究[D];湖南农业大学;2011年
3 李宏思;聚磷菌的筛选鉴定及其在油脂废水除磷中的应用[D];黑龙江大学;2013年
4 任世英;一株海洋聚磷菌YSR-3的分离鉴定及其细胞内致密颗粒的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2005年
5 杨志愿;食品废水中聚磷菌的筛选、鉴定及其功能研究[D];苏州科技学院;2009年
6 张继才;利用反硝化除磷菌处理小城镇污水的现场试验研究[D];山东大学;2006年
7 张勇;荧光原位杂交技术检测反应器中微生物实验条件优化的研究[D];苏州科技学院;2008年
8 胡子全;好氧聚磷菌的分离、鉴定及其聚磷特性的研究[D];安徽农业大学;2008年
9 孙艺萍;聚磷菌的筛选及其体内聚磷酸盐推动PHB积累的研究[D];东北林业大学;2009年
10 连丽丽;聚磷菌的筛选及其对污水的除磷特性研究[D];辽宁师范大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 本报记者 彭芳 实习生 符若;大机械小生物各显神通[N];北海日报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978