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利用大麦基因芯片筛选及克隆簇毛麦抗白粉病相关基因

曹爱忠  
【摘要】: 小麦(T.aestivum L)作为世界性的重要粮食作物,在农业生产中具有举足轻重的地位,但是其生产却受到很多生物胁迫和非生物胁迫的影响。由专性寄生真菌小麦白粉病菌(Erysiphegraminis DC)引起的小麦白粉病(Ergsiphe greminis f.sp.tritici)是中国和世界上许多国家小麦生产中危害日趋严重的病害之一。鉴别新的抗白粉病基因并研究它们的抗性机制变得越来越重要。簇毛麦中的抗白粉病基因Pm21被定位于染色体6V的短臂上,对白粉病抗性强、抗谱广。一方面,研究Pm21基因发挥抗病作用过程中所涉及的转录因子、信号传导途径和重要防卫反应基因,对于研究广谱抗性机理很有意义;另一方面,克隆抗病基因对今后利用基因工程手段提高小麦对白粉病的抗性具有重要意义。 小麦-簇毛麦易位系(6VS/6AL)已经在育种和生产上得到广泛应用,快速准确地鉴定6VS/6AL这条易位染色体的纯、杂合状态,可以提高育种过程中分子标记辅助选择的效率。由于以往开发的与Pm21连锁的分子标记都是显性标记,所以开发一个与Pm21基因连锁的共显性分子标记具有重要应用价值。另外,簇毛麦具有很多优良性状,通过细胞工程手段已经创造了很多异染色体系,所以开发一种能够在小麦背景中快速鉴定簇毛麦染色质的分子标记,可以大大提高鉴定效率。 1、利用大麦基因芯片筛选簇毛麦抗白粉病相关基因及Pm21基因抗性机理研究 为了研究Pm21基因对白粉病的抗性机理,利用经白粉菌诱导抗、感簇毛麦和非诱导的抗病簇毛麦为材料,借助于基因芯片分析手段进行分析。簇毛麦的cRNA与大麦基因芯片杂交,平均有5741个探针有杂交信号。通过比较抗病簇毛麦经白粉菌诱导前后的表达谱,筛选出簇毛麦经白粉菌诱导表达的基因,包括病程相关蛋白、防卫反应基因、转录因子、信号传导因子和抗病基因类似物等。通过比较诱导的抗病簇毛麦的表达谱与诱导的感病簇毛麦的表达谱,筛选出两者的差异表达基因。对这些差异表达基因的信息进行研究的结果表明,抗病簇毛麦中防卫反应受水杨酸和乙烯途径共同调控,而感病簇毛麦中茉莉酸信号途径被诱导,水杨酸途径受到了抑制。在簇毛麦的抗病过程中,水杨酸途径是一种最有效的信号传导途径。 2、抗病相关基因的克隆 根据基因芯片的杂交结果,选择了一些上调表达探针进行后续分析。Contig17515在白粉菌诱导的抗病簇毛麦中的表达量比非诱导的抗病簇毛麦和诱导的感病簇毛麦中的表达量都高。以该序列为模板设计引物,经RT-PCR克隆到一个定位于簇毛麦6VS上的丝氨酸/苏氨酸激酶基因Hv-S/TPK(cDNA),进一步用RACE方法克隆到基因全长。该全长基因共有1376个碱基,编码的310个氨基酸中包含了丝氨酸/苏氨酸激酶的两个保守域(DaKXXN和GTAGYXAPCN/E)。用同一对引物把簇毛麦gDNA中的基因也克隆出来,并定名为Hv-S/TPK(gDNA)。经研究发现来自6VS染色体组的基因Hv-S/TPK(gDNA)与来自6AS、6BS、6DS染色体组的基因Ta-A-S/TPK(gDNA)、Ta-B-S/TPK(gDNA)、Ta-D-S/TPK(gDNA)是直系同源基因,Hv-S/TPK(gDNA)在簇毛麦和易位系6VS/6AL中均能表达,且该基因在B和D染色体组上的直系同源基因Ta-B-S/TPK(gDNA)和Ta-D-S/TPK(gDNA)在易位系6VS/6AL中也能表达。通过对Hv-S/TPK(cDNA)、Ta-B-S/TPK(cDNA)和Ta-D-S/TPK(cDNA)的核苷酸序列推导出的氨基酸序列进行分析,发现有4个氨基酸残基不同,其中的1处是疏水氨基酸和极性氨基酸之间的变化。 用根据Contig17515设计的引物进行PCR,可以从普通小麦的6AS、6BS、6DS和簇毛麦的6VS上扩增出大小不同的PCR条带。用该对引物在(扬麦5号X易位系)F_2群体中进行扩增,发现凡是田间鉴定抗病的单株都能扩增出6VS上的902bp的条带,感病单株则扩增不出这条特异带。另外抗病单株的扩增带型还分两种类型,一种类型的单株扩增不出6AS上的984bp条带,这种单株中的6VS/6AL染色体处于纯合状态;一种类型的单株可以扩增出6AS上的984bp条带,这种单株中的6VS/6AL染色体处于杂合状态。上述结果表明,本研究开发出一种基于PCR的与Pm21连锁的共显性分子标记,把该标记定名为NAU/xibao15_(902)。另外由于该引物只是从第六部分同源群染色体上扩增出大小不同的条带,所以可以用该引物进行PCR,鉴定涉及第六部分同源群染色体发生易位、缺失或添加的异染色体系。 基因芯片杂交结果表明,探针contig3156在抗、感簇毛麦中受白粉菌诱导的程度都最大,并且在抗病易位系中该探针的杂交信号比在感病扬麦5号中的杂交信号强。半定量RT-PCR结果表明:在抗、感簇毛麦和抗、感普通小麦中contig3156这个探针都受白粉菌诱导表达,但在抗病材料中比在感病材料中表达早或上调程度大。contig3156这个探针是一个推导的草酸盐氧化酶基因(Oxalate Oxydase Like Protein,OxOLP)。利用TAIL-PCR方法把簇毛麦中的Hv-OxOLP基因的全长序列克隆出,该基因包含一个内含子和两个外显子,ORF包含690个氨基酸,在启动子区包含两个W-box和一个TATA盒,在终止密码子后面还有一个polyA的加尾信号。由于Hv-OxOLP基因是一个受白粉菌诱导高度表达的基因,并且在抗、感植物材料中都上调表达,所以该基因可能是在植株识别白粉菌的非专化激发子后启动防卫反应时特异表达。鉴于Hv-OxOLP基因启动子的特点,该启动子可以在用基因工程手段改良作物抗病性中发挥作用。 3、建立在直系同源序列比较基础上的小麦进化研究 由于簇毛麦基因Hv-S/TPK(gDNA)和其在小麦中不同染色体组上的直系同源基因的序列之间有一定差异,所以比较小麦族不同物种中该直系同源基因中存在的SNPs可以进行物种进化的研究。将T.aestivum、T.turgidum、T.urartu、T.monococcum、Ae.speltoides、Ae.longissima、Ae.sharonensis、Ae.searsii、T.timopheevii、T.araraticum、A.tauschii中各个染色体组上Hv-S/TPK(gDNA)的直系同源基因片段分别克隆出来,比较了序列之间的相关性,进行小麦族几个不同物种的进化研究。T.timopheevii、T.araraticum中的A染色体组和T.aestivum、T.turgidum两者中的A染色体组之间存在一定的分化,可以分为两类;四倍体T.timopheevii中的A来自T.monococcum,而四倍体T.turgidum中的A染色体组来自T.urartu.B、G的序列与来自Ae.speltoides的序列之间的差异较小,与来自Ae.longissima、Ae.sharonensis、Ae.searsii的序列差异较大;T.timopheevii、T.araraticum两者中的两个G来源相同、T.turgidum、T.aestivum两者中的两个B来源相同,且B和G都可能来自Ae.speltoides。来自普通小麦D组的序列与来自Ae.tauschii的序列同源性非常高,为Ae.tauschii是普通小麦D组的供体提供了又一个证据。


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