收藏本站
收藏 | 论文排版

原果胶酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及酶学性质研究

刘战民  
【摘要】:原果胶酶是能水解不溶性果胶物质为可溶性果胶物质的一类酶。1978年Sakai等首次报道了酵母生产的原果胶酶,之后相继报道了细菌、酵母和霉菌中的原果胶酶的酶学性质及原果胶酶的应用。在中国,有关微生物原果胶酶的研究和应用技术还未见报道,原果胶酶基因在Pichia pastoris中表达的研究在国内外未见报道。本论文主要报道了产原果胶酶B.subtilis XZ2的筛选、原果胶酶基因在Pichia pastoris中克隆表达、重组原果胶酶的纯化和酶学性质等研究内容,研究的主要结果如下: 1.通过对本研究室保藏的菌种进行筛选,获得了一株产原果胶酶的B.subtilis XZ2。以B.subtilis XZ2的基因组DNA为模板,PCR扩增得到原果胶酶基因。测序结果表明:B.subtilis原果胶酶基因全长1200bp,编码399个氨基酸,与GenBank中收录的B.subtilis的原果胶酶基因(GenBank Accession:X74880)相比较,有4个碱基发生了替换,其同源性为99.6%,编码的氨基酸序列同源性为99.5%,二者原果胶酶蛋白基因相应的氨基酸序列、氨基酸残基个数、位置几乎完全相同,仅有2个氨基酸不同。同时,替换的氨基酸不位于原果胶酶的两个保守区域。 2.扩增的原果胶酶基因与毕赤酵母载体pPICZαA经限制性内切酶XhoⅠ和XbαⅠ双酶切,回收片段经T4 DNA ligase、16℃过夜连接,连接产物经CaCl_2转化E.coli DH5α,获得重组酵母表达载体pPICZαA-PPase。经限制性内切酶BstⅪ线性化的pPICZαA-PPase载体与酵母感受态细胞X-33在1500V,25μF,200Ω条件下电转化,经过100、200、400、800μg和1000μg/ml zeocin筛选和酵母基因组PCR鉴定,最终获得重组表达菌株X-33/pPICZαA-PPase。 3.对影响X-33/pPICZαA-PPase表达原果胶酶的培养基、诱导时间、甲醇浓度、诱导前菌体生长量、诱导培养基pH以及PTM1添加量等因素进行了研究,结果显示在使用BMGY/mBMMY培养基、诱导环境pH6.0、0.006%PTM1、诱导前最佳菌体0D600为6-8、1%甲醇诱导、转速240r/min,30℃诱导培养96h,可以获得较好的表达水平;高密度发酵阶段,控制溶氧20%,氨水流加控制培养基pH 6.0,经过210h发酵培养菌体光密度超过了250,湿菌体达到了192g/L,蛋白含量为3.21g/L,原果胶酶活性达到最高240.2 U/ml。 5.摇瓶发酵获得的原果胶酶粗酶液经过硫酸铵沉淀、Sephadex G75凝胶过滤和Sepharose Fast Flow离子交换层析分离,比活力分别提高为219.27 U/mg、752.48 U/mg、1948.64 U/mg,纯化倍数分别为2.13、7.31和18.91,最终获得的原果胶酶经SDS-PAGE电泳测定分子量为43.17 kDa。 6.原果胶酶最适作用温度和pH分别50℃和7.0。在pH 3-10范围内,原果胶酶活性很稳定,热稳定性为50℃以下。金属离子对于原果胶酶活性抑制强弱顺序为Hg~(2+)>Cu~(2+)>Ba~(2+)>Mn~(2+),而Fe~(2+)和Mg~(2+)对该酶没有抑制作用。Ca~(2+)能够提高原果胶酶活性,当浓度为0.20 mM时,原果胶酶活性提高到原来的2.5倍左右,EDTA完全抑制原果胶酶活性。原果胶酶的Km为0.851 mg/ml,Vmax为0.445μmol/min。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 尤华,陆兆新,冯红霞;微生物原果胶酶的研究进展[J];工业微生物;2002年01期
2 张一青,陆兆新,邹晓葵;N~+离子注入对Aspergillus sp.产原果胶酶的诱变效应[J];辐射研究与辐射工艺学报;2005年03期
3 张一青,陆兆新,尤华;原果胶酶提取桔柚皮中果胶的研究[J];食品科学;2005年01期
4 尤华,陆兆新,冯红霞;曲霉液体发酵产原果胶酶的条件优化研究[J];微生物学通报;2003年01期
5 陆兆新,尤华,吕凤霞,孙擎柱;微生物原果胶酶高产菌株的筛选及发酵特性的研究[J];食品科学;2003年10期
6 刘战民;陆兆新;吕凤霞;别小妹;赵海珍;;毕赤酵母工程菌原果胶酶的分离纯化[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2006年01期
7 刘战民,陆兆新,吕凤霞,别小妹,赵海珍;枯草芽孢杆菌产原果胶酶发酵条件研究[J];食品科学;2005年10期
8 张海燕;吴天祥;;微生物果胶酶的研究进展[J];酿酒科技;2006年09期
9 唐尧春;;猕猴桃中果胶物质的测定[J];今日种业;1982年03期
10 王强;范雪荣;高卫东;陈坚;;生物酶在棉织物精练加工中的应用[J];纺织学报;2006年08期
11 徐谷仓;棉织物生物酶前处理工艺[J];印染;2002年12期
12 黄茂福;染整用酶制剂的研究与开发现状(Ⅱ)[J];印染助剂;2004年05期
13 萧伟祥;;萎凋中多酚氧化酶活性的变化[J];茶叶通讯;1986年03期
14 姚漪;;影响番茄酱粘度、色差因素的分析与控制[J];石河子科技;2006年04期
15 李学贵;;榨菜的主要成分与腌制加工关系的探讨[J];上海调味品;1993年02期
16 方元超,梅丛笑,赵晋府;茶饮料生产中添加剂选择的探讨[J];中国食品添加剂;1999年04期
17 孙越;果胶酶活性的测定方法[J];食品科技;1997年03期
18 赵丽莉;田呈瑞;纪花;吕爽;;微生物果胶酶研究及其在果蔬加工中的应用进展[J];现代生物医学进展;2007年06期
19 许均华;李高阳;李志坚;;高产果胶酶菌株的选育及其发酵生产的研究进展[J];食品与机械;2011年01期
20 杜全模;四川榨菜加工的基本原理及其在生产上应用的初步探讨[J];中国酿造;1989年02期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 蒋少军;李志忠;张新璞;;亚麻纤维的酶处理技术[A];雪莲杯第10届功能性纺织品及纳米技术应用研讨会论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘战民;原果胶酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及酶学性质研究[D];南京农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈佳;产原果胶酶菌株的筛选、发酵条件优化及基因的克隆和表达[D];华东理工大学;2013年
2 尤华;原果胶酶产酶菌株的筛选、发酵条件及酶学性质的研究[D];南京农业大学;2002年
3 杨汝剑;产原果胶酶青霉菌Y702的发酵优化与内切聚阿拉伯糖酶的克隆表达[D];华东理工大学;2014年
4 孟浩;高产原果胶酶菌株的筛选鉴定及在桔皮果胶提取中的应用[D];中南大学;2008年
5 王炎松;Pectate lyase基因的克隆分析及其表达载体的构建[D];华南热带农业大学;2006年
6 王鑫;植物果胶酸盐裂解酶在大肠杆菌中的重组表达研究[D];南京师范大学;2006年
7 陈应娟;四川黑茶品质形成研究[D];四川农业大学;2011年
8 刘连成;高温碱性果胶酶菌株的分离、特性研究及果胶酶基因的表达[D];南京农业大学;2007年
9 杨慧芳;降解烟梗果胶质微生物筛选及产果胶酶的研究[D];江南大学;2012年
10 姚利玄;腌制萝卜工艺及黄变与脆度的关系研究[D];华中农业大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前4条
1 李静海;果胶酶整理技术最新进展[N];中国纺织报;2003年
2 中国农业科学院畜牧研究所 张军民 韩怀动;酶制剂在饲料中的作用[N];中国畜牧报;2002年
3 ;添加剂:为茶饮料添彩[N];中国质量报;2002年
4 胡琪 安珉生 冯博导;添加剂使茶饮料更清香[N];中国食品质量报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978