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杀螟硫磷降解菌Burkholderia sp.FDS-1的分离鉴定、生物学特性和有机磷水解酶基因(mpd)的克隆及表达

张忠辉  
【摘要】:从长期受杀螟硫磷污染的土壤中分离到一株以杀螟硫磷为唯一碳源进行生长的细菌,经生理生化鉴定和16S rDNA同源性比较,为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.),将其命名为FDS-1(GenBank Accession No.AY550913)。 对FDS-1的生物学特性进行研究,该菌株在pH6.0-7.0生长最好,最适生长温度为30℃,在5-10g/L的盐浓度范围生长较好,以葡萄糖为碳源,以有机氮为氮源的培养基中生长较好。 对FDS-1的降解性能进行研究,该菌株降解杀螟硫磷的最适pH值为7.0,最适温度为30℃,降解杀螟硫磷的速率和起始接种量呈正相关,在浓度为10~500mg/L范围内,杀螟硫磷能迅速降解。通过液相色谱分析,该菌株能在1h内将100mg/L的杀螟硫磷转化为3-甲基-4-硝基苯酚(MNP),在10h时将MNP完全降解,转变成为邻甲基对苯二酚(MHQ),并且在降解过程中检测到亚硝酸盐的存在,可以推断出FDS-1降解杀螟硫磷的部分代谢途径:杀螟硫磷→MNP→MHQ。 在酶学方面,建立了简单、可靠的有机磷水解酶(粗酶)活性定量测定方法,测定了环境因素对其活性影响及其动力学参数。该有机磷水解酶水解杀螟硫磷的最适为pH值7.5,最适反应温度为30℃;粗酶液在20-40℃稳定性良好,在pH7.0-8.0酶能保持较高的活力,在乙醇中酶的活力最高,在有金属离子存在时均会对酶有一定的抑制作用,其对酶的抑制率与金属离子的浓度呈正相关。通过酶的定域试验表明,该菌株的有机磷水解酶存在于细胞内,为胞内酶。 在分子生物学方面,通过构建基因组文库,克隆到两个有机磷水解酶基因(mpd1,mpd2),运用在线分析软件,推断出两个有机磷水解酶的结构基因,信号肽及启动子序列,发现信号肽及启动子序列完全不同。根据基因序列分析结果设计特异性引物,通过PCR扩增到有机磷水解酶结构基因,并将其构建到表达载体pET29a中,转化到E.coliBL21(DE3)中,进行了表达。 通过根癌农杆菌介导,将有机磷水解酶基因(mpd)转入白三叶草中,根据PCR、


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