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分子佐剂对生长抑素基因免疫的作用及其机制研究

薛春林  
【摘要】:以生长抑素基因(SS)与乙肝表面抗原(HBsAg,S)基因融合的真核表达质粒pES/2SS为基础,制备S/2SS与GM-CSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒及细菌DNA等,免疫小鼠及湖羊,探讨影响生长抑素基因疫苗免疫应答及促生长效果的因素,了解生长抑素基因免疫动物的作用机制,建立合适的生长抑素基因免疫程序,为最终获得经济有效的生长抑素基因免疫方法和疫苗、开发促生长、提高畜牧生产效率的新技术奠定基础。 1.S/2SS与GMCSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒的构建 ①pES/2SS-GMCSF表达产物抗原表位预测 应用DNA软件分析质粒pES/2SS-GMCSF及pES/2SS融合基因表达产物的结构和理化特性,发现二者S/2SS区域抗原表位一致。同样,在插入生长抑素氨基酸序列的2个区域存在抗原表位。在pES/2SS-GMCSF质粒中,S/2SS区域以外有另外的抗原表位区,推测GMCSF不改变S/SS表达产物抗原表位,且能够增强生长抑素免疫学活性。 ②S/2SS与GMCSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒的构建及鉴定 酶切pCS/2SS-GMCSF质粒获得GMCSF小片段,插入到pES/2SS(有终止密码子)和pEGS/2SS(无终止密码子,能表达GFP蛋白)大片段中,构建pES/2SS-GMCSF和pEGS/2SS-GMCSF;以pEGFP-N1为质粒载体,类似方法酶切pCGMCSF质粒得到GMCSF小片段,合成CpG基因退火成双链,构建成pE-GMCSF和pE-CpG基因佐剂质粒;酶切、测序鉴定表明,基因的插入位点、方向、序列完全正确。采用脂质体包裹法将重组表达质粒转染COS细胞使其表达,用间接ELISA或荧光显微镜对其表达产物进行检测。结果表明,pEGS/2SS-GMCSF转染72h后的COS细胞检出强烈荧光。ELISA结果显示,质粒表达的融合蛋白均具有SS的免疫学活性,表明融合表达质粒均可在哺乳动物细胞中表达具有生长抑素免疫学活性的融合蛋白,而表达水平pEGS/2SS<pES/2SS<pEGS/2SS-GMCSF<pES/2SS-GMCSF,提示pEGS/2SS-GMCSF、pES/2SS-GMCSF可能具有较好的免疫效果。 2 CpGDNA系列佐剂对生长抑素DNA疫苗(pES/2SS)免疫小鼠的免疫增强作用 选择60只20日龄ICI小鼠,雌雄各半,分为6组,分别用CpG-ODN(单链CpG)、pE-CDG质粒、E.coli DNA(细菌DNA)、脂质体粗品等佐剂联合生长抑素质粒pES/2SS进行免疫。疫苗剂量为20μg/只,佐剂按等量与之混合。初次免疫2周后以相同剂量


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