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柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri)对拌种灵抗性机制的研究

李俊  
【摘要】:拌种灵是一种高效、广谱的内吸性杀菌剂,作为羧基酰胺类杀菌剂中的一个代表品种,它不仅可以防治由担子菌真菌引起的植物病害,还对植物细菌性病害尤其是黄单胞菌具有较好的防治效果。本文以拌种灵(amicarthiazol)及野生敏感型柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)为材料,系统研究了通过紫外诱导的柑桔溃疡病菌抗药突变体的生理生化及分子生物学特性,揭示了柑桔溃疡病菌对拌种灵产生抗性的原因,并从分子遗传学的角度加以验证。 以野生敏感型柑桔溃疡病菌Xcc为亲本,通过紫外诱导获得了3个室内抗拌种灵突变体:Xuv10,Xuv20,Xuv40。拌种灵对柑桔溃疡病菌敏感菌株Xcc的最低抑制浓度(minimal inhibition concentration,MIC)为100μg/mL,而对3个抗药突变体均为400μg/mL;有效中浓度(medium effective concentration,EC_(50))分别为1.4638,33.3473,24.6278和20.4681μg/mL。紫外诱导并没有影响抗药突变体的菌体生长速率和致病力。对抗药突变体的致病力测定显示,活体条件下抗药突变体的致病力与Xcc相比并未下降,即使在低至10~2cfu/mL浓度的菌液仍能在柑桔叶片上产生典型的溃疡症状。 采用PCR方法扩增并克隆了X.axonopodis pv.citri野生敏感型菌株Xcc及其抗药突变体的致病基因pthA及与之功能密切相关的hrpF、hrpB_2基因。pthA、hrpF和hrpB2基因全长分别为3492bp、2475bp和393bp,G+C%含量分别为66.87%、58.42%和60.05%,其编码的蛋白分别具有1063、824和130个氨基酸,大小分别为122.33504、88.4609和13.799kDa,等电点分别为8.21、5.52和8.29。序列对比分析发现,在致病基因pthA中,存在着14.5个102bp的衔接重复序列(102bp tandem repeats),3个核定位信号(nuclear localization signals)。但是在Xcc及其抗药突变体的pthA、hrpF、hrpB_2基因中,均未发现基因突变,抗药性的产生与它们无直接关系。 采用氯化三苯基四唑氮(triphenyltetrazolium chloride,TTC)法测定了拌种灵对柑桔溃疡病菌野生型及抗药菌株琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。结果发现,抗药突变体的琥珀酸脱氢酶活性显著的低于野生型菌株。在不加拌种灵处理的情况下,Xcc及其


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