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大豆GmNAC和GmLFY转录因子编码基因的克隆、鉴定和种子性状的QTL定位研究

孟庆长  
【摘要】: 种子发育研究是植物生物学和育种研究工作中的一个重要组成部分。大豆种子发育是一个非常复杂的、由多基因协调控制的过程。在这一过程中,转录水平上的调控起着重要的作用。NAC和LFY同源蛋白是其中两类非常重要的植物特异转录因子。NAC蛋白编码基因参与包括植物生长发育、胁迫应答等在内的多种植物生理生化过程。而编码LFY同源转录因子的基因主要参与植物开花时间的调控、花发育等重要的生殖发育过程。 本研究的主要内容是参与大豆种子发育过程中编码NAC和LFY同源蛋白基因的克隆和鉴定以及大豆主要种子性状的QTL分析,以期为大豆的种子发育机理研究和遗传改良打下基础。 首先,从大豆中克隆了6个编码NAC同源蛋白的基因序列并描述其分子特征。序列分析表明6个GmNAC基因编码的蛋白序列均包括一个位于N-末端的同源性较高且十分保守的NAC结构域和一个位于C-末端的高度可变区域。其中NAC结构域由A-E5个亚结构域组成。GmNAC基因结构十分相似,均由3个外显子和2个内含子序列组成,前两个外显子编码保守的NAC结构域,两个内含子在基因中的存在位置具有明显的保守性。RT-PCR分析表明GmNAC4和GmNAC6为组织组成性表达,而其它4个基因的表达都具有特异的表达模式。在4轮花器官中GmNAC3,GmNAC4和GmNAC6呈组成性表达,其它3个基因的表达模式略有差异。GmNAC基因在不同发育时期大豆种子中的表达具有协同性:种子发育前期基因表达量较少,在开花后30-35天种子中的表达量均达到最大值,随后又有所降低,呈“钟形”表达模式。SA,NaCl和机械伤害处理后,GmNAC基因在叶片中表达模式不尽相同。这表明,GmNAC基因参与非生物胁迫应答过程,但是所起的作用可能有所不同。亚细胞定位研究表明GmNAC5蛋白可以定位到细胞核中。系统发育分析表明GmNACl-GmNAC6可以分为5个不同的亚组,GmNAC3和GmNAC4属于AtNAC3亚组,GmNAC1,GmNAC2,GmNAC5,GmNAC6分别属于NAP,ATAF,NAM和TERN亚组。GmNAC基因的克隆和鉴定为进一步阐明和探讨大豆NAC转录因子的功能奠定了基础。 采用RACE的方法从大豆花芽cDNA中克隆了大豆LFY同源cDNA序列(GmLFY)。成功开发出GmLFY基因特异的CAPS标记,利用遗传作图群体NJ(SP)BN将此标记定位到后文构建的大豆分子连锁图谱的C2连锁群上,位于2个SSR标记Sat_213和Satt322之间,距离分别8.0和14.1cM。序列分析表明,GmLFY与拟南芥和豌豆等作物中LFY同源基因的同源性较高。GmLFY基因组序列和cDNA序列比较分析发现GmLFY基因由三个外显子和两个内含子组成,两个内含子在基因中存在的位置也具有明显的保守性。RT-PCR分析表明GmLFY基因主要表达于生殖器官,如花序,荚皮和正在发育的种子等。GmLFY主要在4轮花器官的第1轮和第4轮,即萼片和心皮中表达。GmLFY在不同发育时期大豆种子中的表达分析表明GmLFY在开花后15天表达水平较高,随后略有降低,后来又迅速升高,到开花后35-40天达最大值,随后又有所降低。原核表达结果表明GmLFY可以在大肠杆菌中正确表达并翻译。亚细胞定位研究表明在洋葱表皮细胞中GmLFY可以正确定位到细胞核中。系统发育分析表明GmLFY与豆科作物的LFY同源序列同源性较高,而且LFY同源蛋白的系统发育关系同物种的进化关系十分相似。 利用遗传作图群体NJ(SP)BN,构建了一张基于SSR的大豆分子遗传图谱,图谱覆盖大豆基因组长度为2,854.9cM,包括24个连锁群,共有268个标记位点,标记间平均距离为10.65cM,连锁群上标记平均个数为11.17,平均每个连锁群长119.0cM。这张遗传图谱的构建为控制大豆重要农艺性状的基因定位打下基础。利用这张遗传图谱,结合2年的表型数据,用复合区间作图法(CIM)定位到10个大豆种子相关性状(蛋白质含量,油分含量和种子大小)的QTL,其中共有8个QTL的表型方差解释率在10%以上。在两年试验中重复检测到1个控制蛋白质含量和1个控制油分含量的QTL。大豆种子性状QTL定位对于大豆种子性状的遗传改良具有重要的理论和应用价值。


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