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黑曲霉产酶特性研究及其酶制剂在猪饲料中的应用

郑腾  
【摘要】: 黑曲霉(Aspergillus niger,An)具备产生多种胞外水解酶的能力。以An FJ-008作为出发菌株,经诱变获得了菌株An SL2-111,通过对发酵工艺的优化,确定了An SL2-111最适培养基组成和适宜的工艺条件,并应用于工业化生产。探讨该菌酸性蛋白酶粗酶液的提取技术和纯酶的分离纯化技术,并对其酶学特性、氨基酸组成、动力学性质和活性必需基团进行了研究。采用RT-PCR和PCR技术对An SL2-111的酸性蛋白酶基因进行了克隆和测序。采用An SL2-111生产饲料复合酶制剂,饲喂35日龄长白×大约克二元猪,能提高猪对营养物质的消化吸收率和生长性能。 1 An SL2-111的选育 出发菌株An FJ-008通过紫外线、紫外线和亚硝基胍复合诱变后,获得1260个单菌落,从鉴定平板上挑选到139株变异辐度较大的菌株。将139株变异株按水解圈的大小排列,从不同区域均匀取样,共选取16个菌株。经三角瓶固体发酵培养后,用SPSS10.0对16株菌株所产的酸性蛋白酶发酵酶活、纤维素酶发酵酶活和果胶酶发酵酶活进行相关分析,发现酸性蛋白酶发酵酶活与纤维素酶、果胶酶发酵酶活的变化呈正相关,因此选择以酸性蛋白酶发酵酶活的高低作为菌种筛选的依据。采用此依据经3次复筛后,获得1株酸性蛋白酶高产菌株An SL2-111。 An SL2-111与An FJ-008在形态上有所区别。前者在基础发酵培养基上培养72 h,每克鲜曲酸性蛋白酶发酵酶活达4525 U、果胶酶发酵酶活达701 5 U、纤维素酶发酵酶活达4497 U,分别比出发菌株An FJ-008提高了97.9%、70.1%和13.4%,而且该菌株经斜面传代培养5代,产酶特性稳定。 2 An SL2-111发酵工艺的优化 以酸性蛋白酶发酵酶活为响应值,采用单因素搜索和正交试验对An SL2-111固体发酵工艺进行优化,结果表明An SL2-111适宜在高碳低氮的培养基中生长,添加无机氮源对菌株产酶影响不大。发酵培养基本上可分为两个阶段:第一个阶段为生长培养期(0~24 h),这个阶段菌丝大量形成,基本上不产酶;第二为产孢和产酶阶段(24~60 h)。采用配方培养基和工艺,在250 mL三角瓶中进行验证实验,酸性蛋白酶发酵酶活达6428 U/g,果胶酶和纤维素酶发酵酶活分别为8245 U/g和4911 U/g。 3酸性蛋白酶粗酶液的提取及其稳定剂的研究 比较了不同溶剂从固体发酵物中提取酸性蛋白酶粗酶的效果,结果表明用0.1mol/L乳酸-乳酸钠缓冲液(pH3.5)浸提的效果最好,与2%氯化钠相比回收率提高约50%。在此基础上确立了最适的浸提工艺,即采用10倍的0.1 mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.0)于40℃下浸泡60 min后,酸性蛋白酶粗酶的提取较为完全。在对粗酶液的酶学性质进行研究后表明,其适宜pH范围为2.0~4.0。最适作用pH为3.0,pH稳定性范围为3.0~6.0;适宜的温度作用范围为50~60℃,最适作用温度为55℃,粗酶液在30℃和40℃下都较为稳定。 粗酶液稳定性的试验结果表明,5%的丁醇、5%的山梨酸钾、氯化钠、明胶、黄原胶和淀粉均有利于粗酶液酶活的保存。粗酶液稳定性长效试验表明1%的黄原胶能使粗酶液的酶活在25℃下保持约45 d。 4 An SL2-111酸性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性 采用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法,从An SL2-111的发酵液中提取了一种酸性蛋白酶,经SDS-PAGE验证该酶纯化水平已达到电泳纯。纯化酶的表观分子量约为47×10~3,最适pH值为3.0,最适pH范围为2.6~3.6,pH稳定性范围为4.0~5.0,最适温度为60℃,最适温度范围为50~65℃,该酶有较好的热稳定性,在40℃或50℃下处理60 min,仍保持85%以上的活力。Cu~(2+)、Mn~(2+)对纯化酶有激活作用,Hg~(2+)、Ag~(2+)则对纯化酶有轻度的抑制作用。纯化酶的氨基酸组成中,极性酸性氨基酸占17.29%,极性碱性氨基酸占4.50%,极性中性氨基酸占38.50%,其它为非极性氨基酸;N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ,经序列同源性比对,表明该酶与其它曲霉菌株酸性蛋白酶具有极高的同源性。 酸性蛋白酶对酪蛋白的水解性能最强,对牛血红蛋白及牛血清白蛋白次之,而对鸡卵清蛋白的水解性能最弱。动力学研究结果表明,酪蛋白的米氏常数最小(Km=0.22g/L),最大反应速度Vmax为555.56μg Tyr/min mL,亲和常数最大(Vmax/Km=2525.27),因此酪蛋白是该酶的最适底物。 5 An SL2-111酸性蛋白酶活性必需基团的研究 采用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、对氯汞苯甲酸(PCMB)、N-乙酰咪唑(N-AI)、二硫苏糖醇(DTT)、乙酰丙酮(Acetyl acetone)、顺丁烯二酸酐(MA)、溴代乙酸(BrAc)和碘化-环已基-3-(3-三甲氨基丙基)碳二亚胺(CDC)等8种化学修饰剂对酸性蛋白酶的氨基酸侧链基团进行修饰,然后检测残留酶活,结果表明,色氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基以及二硫键是酶活性必需基团,而氨基、巯基、羧基和精氨酸残基与酶活性无关。 6 An SL2-111酸性蛋白酶基因的克隆与序列分析 采用RT-PCR和PCR技术从An SL2-111的菌丝体中克隆了酸性蛋白酶的基因序列,该序列包含有1339 bp,包含有4个外显子和3个内含子,与An和Aspergillus saitoi的曲霉胃蛋白酶Ⅰ染色体组DNA的核苷酸序列的同源性达到97%,该基因所编码的蛋白质含有前体,N端70~79位氨基酸序列为SKGSAVTTPQ。 7 An SL2-111产饲料复合酶制剂对猪的饲养效果 利用An SL2-111发酵生产的饲料复合酶制剂中含有酸性蛋白酶6290 U/g、纤维素酶4909 U/g、果胶酶5196 U/g和淀粉酶52385 U/g,将其按0%、0.5%、1.0%和1.5%的不同添加量,饲喂35日龄长白×大约克二元杂交仔猪128头,试验期为63d,每21d测定一次增重和耗料、营养物质表观消化率和血液生化指标。结果表明,饲料复合酶制剂能够明显提高仔猪的生产性能和营养物质的消化率,粗纤维、粗蛋白、粗灰分、钙和磷表观消化率的差异均达到显著水平(P<0.05),血清中的总蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖和尿素氮的水平均有不同程度地增加,酶制剂对猪只的心脏、肝脏和肾脏的结构与功能没有影响。所有加酶的处理组中,以0.1%的加酶组效果最好,它能使3个生长阶段的仔猪增重分别比对照组提高13.57%、30.47%和34.10%,料肉比分别降低21.26%、9.88%和13.11%,而且各种营养物质的表观消化率均与对照组有显著差异(P<0.05)。


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