黑曲霉产酶特性研究及其酶制剂在猪饲料中的应用

【摘要】： 黑曲霉(Aspergillus niger，An)具备产生多种胞外水解酶的能力。以An FJ-008作为出发菌株，经诱变获得了菌株An SL2-111，通过对发酵工艺的优化，确定了An SL2-111最适培养基组成和适宜的工艺条件，并应用于工业化生产。探讨该菌酸性蛋白酶粗酶液的提取技术和纯酶的分离纯化技术，并对其酶学特性、氨基酸组成、动力学性质和活性必需基团进行了研究。采用RT-PCR和PCR技术对An SL2-111的酸性蛋白酶基因进行了克隆和测序。采用An SL2-111生产饲料复合酶制剂，饲喂35日龄长白×大约克二元猪，能提高猪对营养物质的消化吸收率和生长性能。 1 An SL2-111的选育 出发菌株An FJ-008通过紫外线、紫外线和亚硝基胍复合诱变后，获得1260个单菌落，从鉴定平板上挑选到139株变异辐度较大的菌株。将139株变异株按水解圈的大小排列，从不同区域均匀取样，共选取16个菌株。经三角瓶固体发酵培养后，用SPSS10.0对16株菌株所产的酸性蛋白酶发酵酶活、纤维素酶发酵酶活和果胶酶发酵酶活进行相关分析，发现酸性蛋白酶发酵酶活与纤维素酶、果胶酶发酵酶活的变化呈正相关，因此选择以酸性蛋白酶发酵酶活的高低作为菌种筛选的依据。采用此依据经3次复筛后，获得1株酸性蛋白酶高产菌株An SL2-111。 An SL2-111与An FJ-008在形态上有所区别。前者在基础发酵培养基上培养72 h，每克鲜曲酸性蛋白酶发酵酶活达4525 U、果胶酶发酵酶活达701 5 U、纤维素酶发酵酶活达4497 U，分别比出发菌株An FJ-008提高了97.9％、70.1％和13.4％，而且该菌株经斜面传代培养5代，产酶特性稳定。 2 An SL2-111发酵工艺的优化 以酸性蛋白酶发酵酶活为响应值，采用单因素搜索和正交试验对An SL2-111固体发酵工艺进行优化，结果表明An SL2-111适宜在高碳低氮的培养基中生长，添加无机氮源对菌株产酶影响不大。发酵培养基本上可分为两个阶段：第一个阶段为生长培养期(0～24 h)，这个阶段菌丝大量形成，基本上不产酶；第二为产孢和产酶阶段(24～60 h)。采用配方培养基和工艺，在250 mL三角瓶中进行验证实验，酸性蛋白酶发酵酶活达6428 U／g，果胶酶和纤维素酶发酵酶活分别为8245 U／g和4911 U／g。 3酸性蛋白酶粗酶液的提取及其稳定剂的研究 比较了不同溶剂从固体发酵物中提取酸性蛋白酶粗酶的效果，结果表明用0.1mol／L乳酸-乳酸钠缓冲液(pH3.5)浸提的效果最好，与2％氯化钠相比回收率提高约50％。在此基础上确立了最适的浸提工艺，即采用10倍的0.1 mol／L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.0)于40℃下浸泡60 min后，酸性蛋白酶粗酶的提取较为完全。在对粗酶液的酶学性质进行研究后表明，其适宜pH范围为2.0～4.0。最适作用pH为3.0，pH稳定性范围为3.0～6.0；适宜的温度作用范围为50～60℃，最适作用温度为55℃，粗酶液在30℃和40℃下都较为稳定。 粗酶液稳定性的试验结果表明，5％的丁醇、5％的山梨酸钾、氯化钠、明胶、黄原胶和淀粉均有利于粗酶液酶活的保存。粗酶液稳定性长效试验表明1％的黄原胶能使粗酶液的酶活在25℃下保持约45 d。 4 An SL2-111酸性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性 采用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-200分子筛层析和高效液相色谱等方法，从An SL2-111的发酵液中提取了一种酸性蛋白酶，经SDS-PAGE验证该酶纯化水平已达到电泳纯。纯化酶的表观分子量约为47×10~3，最适pH值为3.0，最适pH范围为2.6～3.6，pH稳定性范围为4.0～5.0，最适温度为60℃，最适温度范围为50～65℃，该酶有较好的热稳定性，在40℃或50℃下处理60 min，仍保持85％以上的活力。Cu~(2+)、Mn~(2+)对纯化酶有激活作用，Hg~(2+)、Ag~(2+)则对纯化酶有轻度的抑制作用。纯化酶的氨基酸组成中，极性酸性氨基酸占17.29％，极性碱性氨基酸占4.50％，极性中性氨基酸占38.50％，其它为非极性氨基酸；N端氨基酸序列为SKGSAVTTPQ，经序列同源性比对，表明该酶与其它曲霉菌株酸性蛋白酶具有极高的同源性。 酸性蛋白酶对酪蛋白的水解性能最强，对牛血红蛋白及牛血清白蛋白次之，而对鸡卵清蛋白的水解性能最弱。动力学研究结果表明，酪蛋白的米氏常数最小(Km=0.22g／L)，最大反应速度Vmax为555.56μg Tyr／min mL，亲和常数最大(Vmax／Km=2525.27)，因此酪蛋白是该酶的最适底物。 5 An SL2-111酸性蛋白酶活性必需基团的研究 采用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、对氯汞苯甲酸(PCMB)、N-乙酰咪唑(N-AI)、二硫苏糖醇(DTT)、乙酰丙酮(Acetyl acetone)、顺丁烯二酸酐(MA)、溴代乙酸(BrAc)和碘化-环已基-3-(3-三甲氨基丙基)碳二亚胺(CDC)等8种化学修饰剂对酸性蛋白酶的氨基酸侧链基团进行修饰，然后检测残留酶活，结果表明，色氨酸残基、组氨酸残基、酪氨酸残基以及二硫键是酶活性必需基团，而氨基、巯基、羧基和精氨酸残基与酶活性无关。 6 An SL2-111酸性蛋白酶基因的克隆与序列分析 采用RT-PCR和PCR技术从An SL2-111的菌丝体中克隆了酸性蛋白酶的基因序列，该序列包含有1339 bp，包含有4个外显子和3个内含子，与An和Aspergillus saitoi的曲霉胃蛋白酶Ⅰ染色体组DNA的核苷酸序列的同源性达到97％，该基因所编码的蛋白质含有前体，N端70～79位氨基酸序列为SKGSAVTTPQ。 7 An SL2-111产饲料复合酶制剂对猪的饲养效果 利用An SL2-111发酵生产的饲料复合酶制剂中含有酸性蛋白酶6290 U／g、纤维素酶4909 U／g、果胶酶5196 U／g和淀粉酶52385 U／g，将其按0％、0.5％、1.0％和1.5％的不同添加量，饲喂35日龄长白×大约克二元杂交仔猪128头，试验期为63d，每21d测定一次增重和耗料、营养物质表观消化率和血液生化指标。结果表明，饲料复合酶制剂能够明显提高仔猪的生产性能和营养物质的消化率，粗纤维、粗蛋白、粗灰分、钙和磷表观消化率的差异均达到显著水平(P＜0.05)，血清中的总蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖和尿素氮的水平均有不同程度地增加，酶制剂对猪只的心脏、肝脏和肾脏的结构与功能没有影响。所有加酶的处理组中，以0.1％的加酶组效果最好，它能使3个生长阶段的仔猪增重分别比对照组提高13.57％、30.47％和34.10％，料肉比分别降低21.26％、9.88％和13.11％，而且各种营养物质的表观消化率均与对照组有显著差异(P＜0.05)。