水稻半不育突变体W207-2的育性分析及花粉半不育基因的精细定位

【摘要】： 突变体是研究基因表达与功能分析的良好试验材料，也是当前功能基因组学研究的发展方向。雄性不育突变体在植物的育种、遗传学、生殖生物学和分子生物学的研究中提供了很好的材料。为了更好地理解花粉发育的分子机制，需要识别和分离涉及此过程各个阶段的所有基因，并对其特性进行分析。 有关水稻半不育的报道多以籼粳杂种半不育为主，并提出了很多假说，但半不育的分子机制仍不清楚。究其原因，这种半不育是由籼粳间互作引起的，遗传基础较为复杂，不同的组合可能具有不同的不育位点，研究起来较为困难，若能用稳定的半不育材料进行研究，阐明半不育产生的分子机制，对克服生产中遇到的半不育问题具有重要的借鉴意义。为此，本研究对稳定的半不育突变体材料W207-2进行了半不育机制的研究和花粉半不育基因的精细定位，所得结果为从分子水平上揭示水稻及其它禾本科作物半不育性的生物学基础具有重要的指导意义。 本论文主要研究结论如下： 1．用突变体材料W207-2分别与粳稻品种Nipponbare和广亲和品种Dular(籼稻)进行正反交分析表明：W207-2的半不育性受隐性核基因控制，不受细胞质效应的影响。在双目解剖镜下观察到W207-2的花药瘦瘪且开裂性差，而Nipponbare的花药饱满且开裂性好。由于花药开裂性差，造成花粉散出量减少，在荧光显微镜下观察到散落在柱头上的花粉粒和萌发的花粉粒总数减少，继而导致小穗育性降低；花粉的半不育性可能是造成花药开裂性差的原因之一。 2．通过对W207-2／Nipponbare的F_2群体分析表明，半不育性受生育期影响较小，花粉育性与小穗育性呈极显著正相关(r=0.9119)；对W207-2/Nipponbare的F_2群体中291个单株和W207-2／／W207-2／Nipponbare群体中137个单株的遗传分析表明，W207-2的半不育性受1对隐性核基因控制；分别用W207-2和Nipponbare的花粉给W207-2及不育系六盐189A、丙8979A和9522A进行辅助授粉，验证了W207-2的半不育性主要表现为花粉半不育，雌配子育性正常。 3．通过石蜡切片对Nipponbare和W207-2的小孢子发育过程进行观察，发现W207-2的花药在造孢细胞和花粉母细胞时期，药室中有染色极深的“染色质黑块”，造成花粉母细胞减数分裂异常而导致小孢子部分败育；W207-2的绒毡层延迟解体是其小孢子部分败育的另一原因。此外，W207-2的药隔微管束发育不良及药室发育异常也可能是其半不育性的一个原因。用整体染色-透明法观察Nipponbare和W207-2的胚囊育性，发现其育性正常。W207-2的半不育性主要是由其雄配子发育不良造成。 4．利用间接酶联免疫(ELISA)检测技术，测定了水稻半不育突变体W207-2及其野生型Nipponbare在幼穗发育过程中叶片、幼穗和花药中内源IAA，GA_4，iPA，ZR和ABA含量的动态变化。结果表明：在W207-2的叶片，小穗和花药中IAA，GA_4和iPA的含量均低于Nipponbare，且IAA+GA_4+iPA与ABA+ZR之比值也始终低于Nipponbare，而ZR和ABA的含量则高于Nipponbare，提示W207-2叶片，幼穗和花药中IAA，GA_4，iPA，ZR和ABA含量出现了异常，且IAA，GA_4和iPA亏缺以及ZR和ABA盈积可能与半不育发生有关。 5．选择花粉育性作为育性指标，随机选择W207-2／Dular F_2分离群体中的20株半不育单株及20株可育单株，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成半不育混合基因组池和可育混合基因组池。对两混合基因组池进行全基因组SSR分析，分别在第5、7和8染色体上检测到有多态的标记。随后用W207-2／Dular F_2群体中的182个单株构建了第5、7、8染色体的分子连锁遗传图谱，并进行了QTLs检测，在第8染色体上标记RS41和RM6356之间检测到1个花粉半不育位点，命名为pss1，其LOD值为48.3，贡献率为70.5％。 6．以W207-2与Nipponbare杂交F_2群体中291个单株对花粉半不育基因进行定位，确定了原始花粉半不育基因突变位点为位于第8染色体上的pss1，即由正常品种Nipponbare变为花粉半不育W207-2是pss1位点上基因突变的结果。进一步用9600株W207-2／Dular F_2分离群体中2100株纯合隐性半不育个体将该半不育基因pss1精细定位于CAPs标记L2和dCAPs标记L3之间，距两标记的距离均为0.02cM。两标记位于同一PAC克隆P0470F10上，物理距离约为28kb，对此片段进行分析，预测到5个完整的开放阅读框，分别为：putative ribonuclease PH，putative avr9 elicitor response protein，kinesin1-like RNA-binding protein，putative RNA-binding protein RNP-D precursor和putative 40S ribosomal protein S13。