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赤霉菌侵染后小麦穗部表达蛋白的差示分析及钙网联蛋白基因的克隆研究

王云  
【摘要】: 小麦赤霉病是一种全球性的小麦病害,严重地影响着小麦的产量和品质。赤霉病抗性机理不清楚、遗传机制复杂,这在很大程度上影响了对小麦赤霉病的控制。因此,小麦赤霉病抗性机理的研究,无论是对基础研究还是对应用研究中都具有重要意义。 蛋白质组学分析是功能基因组学研究中一种重要的手段,已在遗传学、生理学、病理学等多个领域得到了广泛的应用。本研究以抗赤霉病小麦品种望水白为材料,构建了F. graminearum侵染前和侵染后6、12、24小时小麦穗部蛋白的表达谱。通过比较侵染前后蛋白表达水平的变化,得到了117个在侵染后与侵染前呈现出2倍表达水平差异的蛋白质点,并对其中的30个蛋白质点进行了质谱分析鉴定。其中,烯醇化酶、脂酰CoA还原酶等一系列与代谢相关的蛋白质表现出下调表达趋势;而一些与胁迫应答相关的蛋白,如热激蛋白、钙网联蛋白、LRR类似蛋白则表现出上调表达的趋势。利用中国春缺体-四体材料对这30个差异表达蛋白的基因进行了染色体定位研究,将编码受铁抑制ABC转录因子、木葡聚糖-1,4-D-葡萄糖苷酶、磷酸核酮糖激酶、蔗糖-果聚糖6-果糖基转移酶、Mla类似蛋白、dnaK热激因子70、钙网联蛋白、jacalin类似蛋白LEM2、β-葡萄糖苷酶、CONSTANS类似蛋白的基因分别定在了小麦2B/3B、6B、2D、4B、1A、5A、5A、2D、7D和3A染色体上。 用RT-PCR的方法,从F. graminearum侵染后6小时的小麦穗部分离了钙网联蛋白基因的全长cDNA克隆,并将其命名为TaCRT(Accession no. AAW02798)。该基因编码一包含415个氨基酸残基的多肽,与大麦钙网联蛋白基因的相似性达96%。序列比对分析发现植物钙网联蛋白间的相似性很高,除了N-domain、P-domain和C-domain三个保守的功能结构域外,还存在着糖基化、豆蔻酰化和核定位等保守的基序,在进化上则分成单子叶和双子叶两族。染色体定位结果表明,TaCRT位于小麦染色体5A长臂上;表达分析结果表明:TaCRT在不同组织、不同发育阶段表现为组成型表达,而在BA、高温、F. graminearum及PA诱导的细胞程序性死亡过程中表现出上调表达的趋势。 为进一步验证钙网联蛋白Ca~(2+)结合特性,构建了pET32a-TaCRT-E.coli BL21的原核表达系统,分离纯化表达的钙网联蛋白,用偶氮胂Ⅲ法测定得到钙网联蛋白的平均Ca2+结合容量为33.3。 为进一步研究TaCRT基因在植物抗病反应过程中可能的生物学功能,我们利用农杆菌介导的叶盘转化法,得到了TaCRT过量表达的转基因烟草植株,PCR和GUS活性检测结果表明TaCRT已经成功地转入烟草植株。烟草花叶病的侵染实验结果表明:转基因烟草植株对烟草花叶病毒的抗性明显提高。


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