松材线虫实时荧光检测和腐烂茎线虫种群分化的研究

【摘要】： 1松材线虫real-time PCR检测技术研究 松材线虫病(Pine Wood Nematode)是当前严重危害我国和世界林业安全的森林毁灭性病害，其病原物松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner Buhrer)Nickle]是我国禁止进境的检疫性线虫。不过，伞滑刃属(Bursaphelenchus)线虫中除松材线虫外，其它线虫并未引起明显的植物病害。因此，建立一套快速、准确的松材线虫诊断方法，对口岸检疫和保护我国林业安全具有重要意义。实时荧光PCR是近年发展起来的新一代PCR技术，相比普通PCR方法，具有快速，环保，操作简便等优点。本研究设计合成了松材线虫的TaqMan探针及其配套引物，并且在对7个松材线虫种群，7个拟松材线虫种群以及水对照进行的实时荧光检测中，快速准确的将松材线虫检测出来。实时荧光PCR法的检测灵敏度可达1／20条线虫。 2腐烂茎线虫、鳞球茎茎线虫和食菌茎线虫的PCR-RFLP分析 甘薯茎线虫病是农业上重要病害，其病原腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为重要检疫性线虫。腐烂茎线虫最初是在马铃薯上发现的，并导致马铃薯腐烂。但在我国主要危害甘薯的生产。本实验对7个腐烂茎线虫群体，2个鳞球茎茎线虫群体以及1个食菌茎线虫群体的ITS区进行了PCR扩增和RFLP等分析，获得了以上10个群体的RFLP图谱，并通过网络软件Clustalw1.82对三种茎线虫的核糖体ITS区核酸序列进行了比对。扩增结果表明，腐烂茎线虫7个供试群体出现了两种扩增条带，分别为790 bp和970 bp说明腐烂茎线虫的不同群体间很可能出现了分化现象；2个鳞球茎茎线虫群体DiIT和DiGR以及来自浙江温州的1个食菌茎线虫群体Dmzw的扩增片段也在800 bp左右。酶切结果显示：2个山东的腐烂茎线虫群体与其他地区的5个腐烂茎线虫群体在RsaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、AluⅠ4个酶的酶切位点上存在明显差异；虽然2个鳞球茎茎线虫群体和1个食菌茎线虫群体的PCR扩增产物均为800 bp左右，但通过对这2个虫种的RFLP图谱进行比较发现，它们在全部5个酶切位点上都存在较大差异。序列比对结果发现，ITS1序列在种内表现了很大大的差异，而ITS2序列则是在种间的差异过大，单独的ITS1和ITS2序列都不适合茎属线虫的系统发育分析。根据ITS1和ITS2序列构建了三种茎线虫的系统发育树，发现鳞球茎茎线虫首先从古老的祖先中分化出来，而腐烂茎线虫与食菌茎线虫在之后发生分化。