APP广东分离株生物学特性研究及其apxII C基因缺失重组载体的构建

【摘要】： 猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。 本论文主要是研究传染性胸膜肺炎放线杆菌广东分离株的生物学特性，初步建立了一套猪传染性胸膜肺炎的PCR检测方法，在此基础上构建apxⅡC基因缺失的胸膜肺炎放线杆菌突变载体，为减毒活疫苗的研制奠定基础。 1．胸膜肺炎放线杆菌的生物学特性的研究 对胸膜肺炎放线杆菌血清1型广东分离株进行了培养特性的观察，“卫星”现象、CAMP试验及糖发酵、尿素酶试验均符合猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的生物学特性。对培养基中不同的NAD和小牛血清对APP生长的影响的研究结果表明，APP在含有8.0％小牛血清和5μg/mL NAD的TSB培养基中生长最好。利用浊度测定对APP 1型菌在TSB的生长曲线进行测定，发现其在24h进入稳定期。而且，APP 1型菌在TSB中的生长具有明显的对数生长期，可用于APP的攻毒试验。致病性试验表明，APP 1型广东分离株对小鼠的半数致死量为1.14×10~9 CFU。 2．基于apxⅣA基因的PCR检测方法的初步建立 根据GenBank上公布的猪胸膜肺炎放线杆菌的apxⅣA基因序列，设计一对引物，初步建立了猪传染性胸膜肺炎的PCR诊断方法。以胸膜肺炎放线杆菌血清1型和7型标准菌株、本研究所分离的APP，实验室保存的巴氏杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌为模板进行PCR检测。结果表明，APP标准株、分离菌株均检测到apxⅣA基因，扩增出的特异片段大小约400bp，而其它对照菌均未检出。 3．重叠延伸PCR方法构建apxⅡC突变载体PBS-CA(-) 胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡCA基因由激活基因apxⅡC和结构毒素基因apxⅡA组成，apxⅡC基因失活后突变株的毒力大大降低，但并不影响结构毒素蛋白ApxⅡA的分泌表达。本研究采用PCR从本室分离鉴定的APP野毒株血清1型基因组DNA中扩增最主要的毒素蛋白编码基因apxⅡCA并进行序列测定，经BLAST比较，与国外APP血清1，2，3和7型菌株apxⅡCA基因在核苷酸上同源性达99％以上。 通过重叠延伸PCR方法将apxⅡC基因缺失，并将该DNA片段克隆到PBS-T载体中构建了apxⅡC基因失活的转移载体pBSCA(-)。 4．重组质粒转移载体PBSCA(-)OSA的构建 分别PCR扩增了胸膜肺炎放线杆菌的omlA启动子基因、枯草芽孢杆菌sacB基因和amp抗性基因，并克隆到pBS-T载体中构建了质粒PBS-OSA。进而将-omlA-sacB-amp~r表达盒连入质粒PBS-CA(-)，构建了重组质粒转移载体PBSCA(-)OSA。