稻米脂肪含量QTL分析及二酰甘油酰基转移酶基因的克隆

【摘要】： 随着水稻产量的基本稳定和人民生活水平的不断提高，人们对稻米品质的要求也越来越高。食味品质和营养品质皆优的稻米已经成为水稻品质育种的一个趋势。脂肪是稻米重要的营养物质之一，研究证明脂肪含量与稻米的食味品质呈正相关。脂肪含量高的米蒸煮后，米饭表面油亮，且冷饭口感也不会降低。在一定范围内提高脂肪含量，可以改善米饭的香味，光泽度和适口性。因此，当通过改良稻米的食味品质指标如直链淀粉含量，胶稠度和糊化温度不能改善米饭口感时，可以通过提高稻米脂肪含量来改良稻米的食味品质。但是，目前对稻米脂肪的相关研究还很少，而且现有的研究都是对稻米脂肪含量进行经典的遗传学分析和利用单个群体在单个环境下进行QTL定位。有限的遗传信息在一定程度上限制了利用分子手段改良稻米的脂肪含量，从而也制约了对稻米食味品质和营养品质的分子设计育种进程。为了对稻米脂肪含量的遗传基础有更全面的了解，更好地利用分子手段改良稻米油脂品质，提高稻米的食味品质，本文主要进行了以下五个方面的研究： 1．利用BIL群体分析不同环境中控制稻米脂肪含量的QTL 利用Nipponbare／Kasalath／／Nipponbare回交重组自交系(Backcross Inbred Lines，BILs)作图群体(BC_1F_9)和复合区间作图QTL定位方法，分析2003年南京，2004年南京和2003年海南三个不同环境中糙米脂肪含量QTL的表达情况。在三个环境中，共检测到7个控制脂肪含量的QTLs，分别位于第2、3、4、5和7染色体上，贡献率变幅为5．48-23．17％。位于R3166-C249区间的qFC-5-1在2003年南京和2003年海南被检测到，对表型的贡献率分别为11．7％和17．43％，正加性效应来源于亲本Nipponbare等位基因。位于C847-R1789区间的qFC-7，在2003年南京对表型的贡献率为23．17％，是所有QTL中贡献率最大的；在2004年南京对表型的贡献率为7．50％，但是该QTL在两个环境中遗传效应方向发生了改变。其它的QTL均是在一个环境中被检测到，对表型的贡献率都相对较少。 2．利用RIL群体对不同环境争发育时期控制稻米脂肪含量QTL进行定位 以水稻杂交组合Asominori×IR24衍生的71个重组自交F_(10)家系为材料，在2005年南京灌浆初期(E1)、灌浆中期(E2)、灌浆末期(E3)和成熟期(E4)以及2004年南京成熟期(E5)和2003年海南成熟期(E6)6个环境对稻米脂肪含量进行分析，利用复合区间作图QTL定位方法共检测到17个控制脂肪含量的QTLs，LOD值变幅为2．07-4．45，对表型的贡献率在7．2-17．38％之间，两个亲本中既有增效的等位基因也有减效的等位基因。其中qFC-1-2和qFC-11-3可在两个环境中检测到，其它的QTL仅在一个环境中检测到。四个发育时期，共检测到11个控制脂肪含量的QTLs，对表型的贡献率在7．2-14．19％之间，只有qFC-11-3可在两个不同的灌浆时期检测到，其它的QTL均是在一个时期检测到。对三个不同地点成熟期的脂肪含量分析，共检测到10个控制脂肪含量QTLs，所解释表型变异的贡献率在9．36-17．38％之间，均是在一个环境中检测到。结果表明控制脂肪含量QTL的表达具有较强的环境特异性和时空有序表达的特性，大多数QTL仅在一个环境中或一个发育时期检测到。 3．水稻籽粒不同灌浆时期脂肪含量和脂肪指数的动态QTL分析 利用由粳稻品种Asominori与籼稻品种IR24的杂交组合衍生的重组自交F_(10)家系(Recombinant Inbred Lines，RIL)群体，采用非条件和条件QTL定位方法，对水稻籽粒灌浆四个时期的脂肪含量(Fat Content，FC)和脂肪指数(Fat Index，FI)进行分析。四个不同的灌浆时期共检测到11个控制脂肪含量的非条件QTLs和10个控制脂肪含量的条件QTLs；11个控制脂肪指数的非条件QTLs和8个条件QTLs被检测到。对脂肪含量和脂肪指数的非条件QTL分析中可以检测到两个灌浆时期同时表达的QTL；在条件QTL定位中，所有的QTL均在一个灌浆时间检测到。灌浆前期，灌浆中期和灌浆后期检测出较多的控制FC和FI的QTL。结果表明控制FC和FI的QTL的表达均具有时空特异性。从整个灌浆时期对控制脂肪积累的遗传因子进行非条件和条件QTL分析，可以检测更多的遗传信息。与传统的仅用一个发育时期进行定位的结果比较，不仅提高定位的效率，而且可以更全面地揭示控制稻米脂肪动态积累的遗传信息。 4．稻米脂肪合成途径关键酶基因DGAT2的克隆和表达分析 根据水稻全基因组测序的信息设计引物，利用RT-PCR方法，从水稻中克隆了二酰甘油酰基转移酶基因2(DGAT2)。对OsDGAT2推测的氨基酸序列进行分析表明：OsDGAT2编码的蛋白质序列与水稻中已知的二酰甘油酰基转移酶序列同源性仅为17％；与水稻基因组测序后预测的一个具有二酰甘油酰基转移酶功能的序列同源性为77％。OsDGAT2与哺乳动物，真菌和植物中已经克隆的DGAT2同源性分析表明，OsDGAT2与油桐的DGAT2基因存在较高的同源性，为44％。OsDGAT2编码蛋白具有一个二酰甘油酰基转移酶保守的结构域和一个磷酸盐酰基转移酶保守的结构域。通过蛋白质序列功能位点分析发现了两个蛋白激酶磷酸化位点，这两个位点可能与上述的磷酸盐酰基转移酶保守的结构域有关。该蛋白在水合特性上具有两亲性，有3个跨膜区。进一步分离克隆了OsDGAT2的基因组DNA序列，具有9个外元，8个内元。组织表达谱分析表明，OsDGAT2与水稻中另外两个DGAT表达模式不同，OsDGAT2在各组织中都有表达，其中在茎，幼苗以及发育中期和成熟期种子中表达量最高。这些研究结果将为进一步研究OsDGAT2的功能以及改良稻米油脂品质，进而改善稻米食味品质提供一定的理论指导。 5．建立了快速测量水稻脂肪含量的近红外光谱分析方法 传统的分析脂肪含量的方法存在速度慢和需要破碎样品等缺点。近红外光谱分析技术(NIRS)具分析速度快、无污染、不需破碎样品、可同时分析多种组分等优点，在一定程度上弥补了传统方法不足。目前已经在农作物品质育种、农牧产品质量分析、食品加工和品质检测等领域中广泛应用。本研究应用近红外光谱(NIRS)分析技术和偏最小二乘法(PLS)建立了四个稻米脂肪定量分析数学模型，并比较了糙米粒和糙米粉，精米粒和精米粉所建数学模型对预测稻米脂肪含量的效果差异。结果表明：在校正模型中，决定系数(R~2)分别为0．79，0．84，0．89和0．91，相应的均方根差分别为0．16％，0．14％，0．09％和0．08％；在内部交叉验证中R~2为0．73，0．81，0．81和0．89，相应的均方根差分别为0．17％，0．15％，0．12％和0．09％；在外部交叉验证中R2分别为0．62，0．80，0．81和0．87，相应的均方根差分别为0．25％，0．31％，0．28％和0．30％。粉末状样品所建模型的预测效果好于颗粒状样品，颜色比较均一的精米样品所建模型的预测效果好于糙米样品。以上研究结果表明近红外光谱分析技术在预测水稻脂肪含量时具有较高的准确性，可以在短期内分析大量的样品，在水稻重要种质资源和突变体资源的筛选以及早代育种中具有重要的应用价值。