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水稻脂氧合酶基因OsLOX1的克隆功能分析

汪仁  
【摘要】: 本研究通过设计简并引物、RT-PCR扩增并结合RACE方法克隆得到水稻脂氧合酶基因OsLOX1,原核表达并结合生化分析方法测定OsLOX1的酶学特性,对该基因的结构特点、表达特性进行了研究。在此基础上,利用农杆菌介导将正义和反义OsLOX1基因导入水稻植株,探讨OsLOX1在植物体内的生理功能及其与抗虫性的关系。 研究结果如下: 1水稻种子成熟和萌发过程中脂氧合酶同工酶活力分析 利用本实验室筛选到的LOX-3缺失突变体北陆PL2和正常的水稻品种越光,研究种子成熟及萌发过程中LOX活性的变化规律,发现2个水稻品种在种子成熟及萌发过程中LOX活性变化规律基本一致,即开花后的10—25天活性持续升高,以后趋于下降,但在LOX-3缺失的品种(北陆PL2)中变化很小;在萌发初期LOX活性迅速升高,浸水萌发后2天达到峰值,然后随萌发时间的延长而下降。同工酶分析显示,在水稻成熟过程中种子LOX-3表达水平及活性都显著高于其它两种酶,而在种子萌发过程中LOX-2表达水平和活性占优势,LOX-1则在两种情况下都显示较低的表达水平和活性。研究也进一步证明北陆PL2是LOX-3缺失的水稻品种。 2水稻成熟过程种胚RNA提取方法的建立 建立了一种全新、简单的提取水稻种胚RNA的CTAB-LiCl提取法,可在不用液氮的室温下有效地排种胚中大量带有的多糖和本身脂质的干扰,所得RNA样品经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析证明具有较高的纯度和完整性,并可进一步满足RT-PCR、Northern印迹以及cDNA文库构建的实验需要,适用于富含多糖和脂质的植物组织RNA的提取。 3水稻种子脂氧合酶基因OsLOX1的克隆、序列分析与表达规律研究 根据脂氧合酶的保守序列设计简并引物,利用RT-PCR方法,从水稻种胚中克隆了一个新的脂氧合酶基因cDNA片段。进一步用5'-RACE和3'-RACE的方法得到该基因3154bp的全长cDNA(OsLOX1,GenBank登录号:DQ389164)。进一步克隆了OsLOX1的基因组DNA,OsLOX1基因具有9个外元,8个内元。Southern分析显示该基因在基因组中是单拷贝克隆。分析了该基因启动子序列,发现该启动子含有种子特异表达的顺式元件和多个受伤害以及茉莉酸诱导的顺式作用元件。组织表达谱分析表明,OsLOX1在未成熟胚、萌发过程中的种子及幼苗都以较低的水平表达,在正常的根、茎和叶中都不表达,而三叶期的幼苗经过伤害诱导3小时后OsLOX1表达量最高,且褐飞虱取食后其转录物表达量也急剧升高,至6小时达到最高值。这些结果都表明,OsLOX1的表达受生物和非生物逆境胁迫诱导,参与水稻的防御反应;另外,该酶还参与水稻的生长发育过程。 4水稻种子脂氧合酶OsLOX1在大肠杆菌中的表达与蛋白特性研究 以本实验室克隆到的水稻种子脂氧合酶OsLOX1全长cDNA为模板,用含有特异酶切位点的P1、P2为引物,通过PCR方法得到该基因的编码框全长。将其构建到大肠杆菌表达载体pET30(+)上,转化进BL21(DE3)菌株,获得含OsLOX1的重组工程菌。经过IPTG诱导,水稻脂氧合酶基因OsLOX1的表达产物在表达菌株中大量积累。诱导16小时后用超声波破碎仪裂解表达菌株,裂解液用组氨酸标签试剂盒进行纯化和复性。复性后的蛋白以亚油酸为底物进行酶活测定,结果显示,该蛋白具有明显的脂氧合酶催化活性。利用比色法测得该酶的最适温度为30℃及最适PH值4.8。本实验以原核表达的方法得到、并使用组氨酸标记试剂盒纯化出具有生理活性的水稻种子脂氧合酶OsLOX1,为植物种子脂氧合酶的研究提供了一种可靠的供选择方法,也为更好地研究水稻种子脂氧合酶OsLOX1的结构与功能的关系提供了良好的材料和方法。研究的结果也进一步表明本试验所克隆的基因OsLOX1编码的蛋白可能是水稻脂氧合酶-1(LOX-1)。 5农杆菌介导获得转正义和反义OsLOX1基因水稻植株及其抗虫性鉴定 利用农杆菌介导的方法,将含有水稻脂氧合酶基因OsLOX1的两个双元载体pLOX1S(35SPro.5’+OsLOX1 cDNA+NosTer3’),pLOX1A(35SPro.5’+antisene-OsLOX1 cDNA+NosTer3’),转入粳稻栽培品种北陆PL2中,共得到46个独立的转基因植株。经过潮霉素筛选叶片和PCR验证确定得到32个阳性的转基因水稻植株,阳性率为69.6%。潮霉素筛选叶片、种子和Southern blot等检测都表明,目的基因已经整合到水稻基因组中。RT-PCR、酶活测定的结果都表明,目的基因在转基因水稻中有不同程度的表达。对部分转基因植株进行褐飞虱的鉴定发现,与未转化的对照植株相比,转反义基因的水稻植株降低对褐飞虱的抗性;一部分转正义基因水稻植株能提高对褐飞虱的抗性,而另一部分转正义基因植株由于共抑制的结果也表现降低对褐飞虱的抗性。


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