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β酪啡肽在大鼠胃肠道内的释放、吸收和稳定特性及其对胃肠机能的影响

宗亚峰  
【摘要】: 本文采用β酪啡肽(Beta-casomorphins,βCMs)的RP-HPLC分析方法,系统探索其在大鼠胃肠道内的释放、吸收和代谢特性以及经胃肠道内灌注后对小肠内营养物质(葡萄糖和氨基酸)吸收的影响;结合RT-PCR、原位杂交和免疫组化等技术,研究了βCMs对胃肠主要内分泌激素——胃泌素(Gastrin,GAS)、生长抑素(Somatostatin,SS)和胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)的分泌和基因表达的影响,并在此基础上探讨了其对胃肠内分泌激素调节的可能作用机制,深化了对βCMs生物学功能(尤其是胃肠机能)的认识,为其新功能研究开发提供实验依据。 1大鼠胃肠食糜中CMs的释放及其定量分析 本实验采用βCMs的RH-HPLC分析方法,观察了其在胃肠道内的释放特性。实验包括2个部分。(1)以0.1%H_3PO_4/乙腈:水(3:1)和0.1%H_3PO_4水溶液为流动相,线性梯度洗脱,215nm检测。βCM5和βCM 7的保留时间分别为2.64min和7.43min,在2-500μg/mL浓度范围内具有良好的浓度-峰面积线性关系,理论检测下限(Signal/Noise≥3)分别为35ng/mL和83.3ng/mL,灵敏度高。βCM5和βCM7在胃肠食糜中平均回收率分别高达99.1%,97.3%和97.2%,93.9%。(2)12只刚断奶大鼠均分为对照组和实验组,自由采食基础日粮。对照组和实验组大鼠分别饮用纯净水和奶粉水溶液(200 mg/mL)。饲养4天后同时宰杀,采集胃和十二指肠食糜。饮水组的大鼠食糜中未能检测到βCM5和βCM7,而奶粉处理组的大鼠胃肠食糜中均检测到βCM5和βCM7,其平均含量分别为0.556±0.064μg/g,0.548±0.090μg/g胃食糜和0.441±0.030μg/g,0.144±0.071μg/g肠食糜。结果表明,乳蛋白能在大鼠胃肠道内释放出βCM5和βCM7。胃是βCMs的主要释放部位。 2βCM7在成年大鼠胃和小肠内的吸收特性研究 本实验采用体外胃囊、肠囊吸收和体内阻断吸收技术,观察了βCM7在成年大鼠胃和小肠内的吸收特性。实验包括体内和体外两个部分。(1)将成年大鼠胃和空肠中上段取出,制备成黏膜面外翻的囊腔,放入含有βCM7的培养液中,观察囊腔内βCM7含量的变化。(2)采用结扎消化道吸收血管(胃和十二指肠上覆盖的网膜)的方法,建立阻断吸收模型。在可吸收和阻断吸收两种状态下,比较分析了腔内灌注βCM7的浓度变化,定性判断其在胃和十二指肠内的吸收特性。结果显示,成年大鼠离体胃囊和肠囊腔内均未能检测到βCM7;在可吸收和阻断吸收两种状态下,胃和十二指肠内灌注的βCM7浓度在各个时间点差异不显著;与起始浓度相比,各个时间点的βCM7浓度变化率差异也不显著。体内外的实验结果表明,βCM7不能被成年大鼠胃和小肠粘膜吸收。 3βCM7在胃和小肠内的稳定性研究 本实验研究了胃肠黏膜和主要蛋白酶对βCM7稳定性的影响,初步分析了其酶解产物的组成。(1)体外酶解实验结果显示,在胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧基肽酶A和氨基肽酶的酶解体系中,βCM7浓度没有显著变化;而二肽基肽酶作用10min,βCM7浓度下降了75.45%。与十二指肠黏膜对βCM7的降解速度相比,二肽酶的降解效应占肠道粘膜降解作用的83.19%。(2)酶解产物的色谱结果显示,βCM7在二肽基肽酶作用下能释放更小短肽和氨基酸,其中含有Tyr、Ile和βCM5。由此推断:βCM7能在胃内以完整的7肽结构存在;小肠是其在体内的首要代谢部位,二肽基肽酶是其在肠道内的主要降解酶;短肽是βCM7在肠道内降解产物主要形式,βCM5是βCM7的肠道降解产物之一。 4βCM7对大鼠胃内胃泌素表达和分泌的影响及其机制探讨 本实验探讨了βCM7对胃粘膜中胃泌素基因表达和分泌的影响及其调节机制。实验分为两个系列。(1)48只成年雄性SD大鼠随机为6个处理组,分别灌喂1.5 mL生理盐水、2.5×10~(-4)mol/L NaL、2.5×10~(-4)mol/LβCM7、5×10~(-4) mol/LβCM7+5×10~(-4)mol/L NaL、2.5×10~(-4)mol/LβCM5、5×10~(-4) mol/LβCM5+5×10~(-4) mol/L NaL。每天灌喂两次,30天后宰杀大鼠,刮取胃粘膜。RT-PCR法检测大鼠胃粘膜中GAS和SSmRNA表达的变化。结果显示:持续灌喂βCM7 30天后,大鼠胃粘膜中GAS mRNA表达显著上升52.9%。将NaL(非特异性阿片肽受体阻断剂)与βCM7共同灌喂,GAS mRNA的表达与βCM7组相比下降29.2%,差异不显著(P=0.15)。表明βCM7促GAS基因表达的效应不能被NaL逆转。具有更强阿片样活性的βCM5虽然显著刺激胃黏膜GAS基因表达,但与βCM7处理组相比差异不显著(P=0.877)。βCM7和βCM5均显著降低大鼠胃粘膜中SS mRNA表达,两个处理组之间没有显著差异(P=0.797)。由此推断,βCM7促GAS基因表达效应与其非阿片样活性和SS的反馈性调节有关。(2)24只成年雄性SD大鼠随机分为3个处理组,分别灌喂1.5 mL生理盐水、2.5×10~(-4)mol/LβCM7、0.5×10~(-4)mol/L 7肽Poly-Gly(含氮量与βCM7相同)。连续灌喂30天后宰杀,以胃大弯为中轴线,刮取左侧胃黏膜,固定右侧胃组织。采用RT-PCR、原位杂交和免疫组化技术,观察了βCM7对胃粘膜中GAS和SS mRNA表达和分泌细胞的影响。灌喂βCM7显著刺激胃黏膜内GAS mRNA表达,基因表达量上升52.8%;7肽Poly-Gly虽然也能上调胃黏膜内GAS mRNA表达水平,但差异不显著(P=0.15)。βCM7还能显著下调黏膜中SS mRNA水平,抑制率达30.7%,而7肽Poly-Gly对SS基因水平没有显著影响。原位杂交结果显示,βCM7处理组的大鼠胃底和胃窦黏膜内GAS mRNA阳性细胞数分别显著升高21.9%和17.5%。虽然βCM7处理组的大鼠胃底和胃窦黏膜中SSmRNA阳性细胞数没有显著变化,但阳性细胞的平均灰度值分别显著下降22.0%和19.5%。βCM7处理组和Poly-Gly处理组的大鼠胃窦黏膜中GAS mRNA阳性细胞的平均灰度值分别上升15.3%(P0.05)和22.5%(P0.01)。Poly-GIy处理组的大鼠胃黏膜中SS mRNA阳性细胞的个数和平均灰度值均没有显著变化。免疫组化的结果显示,βCM7处理组的大鼠胃窦黏膜内G细胞数和斑点总面积均显著高于对照组和Poly-Gly组。灌喂βCM7不能显著影响胃底和胃窦内D细胞数,但能显著抑制其灰度总面积。与对照组相比,Poly-Gly组胃窦黏膜内G细胞斑点总面积上升3.8%,但差异不显著(P=0.18),D细胞数和斑点总面积均没有显著变化。上述结果表明,βCM7对GAS基因表达和分泌的调节机制与其阿片样活性和肽的营养刺激作用无关,而与SS旁分泌调节有关。作为胃内稳定存在的腔内信号分子,βCM7表现了其非阿片肽调节效应和肽结构效应。 5βCMs对大鼠十二指肠内的胆囊收缩素表达的影响 48只成年雄性SD大鼠随机为6个处理组,分别灌喂1.5 mL生理盐水、2.5×10~(-4)mol/L NaL、2.5×10~(-4)mol/LβCM7、5×10~(-4) mol/LβCM7+5×10~(-4) mol/L NaL、2.5×10~(-4)mol/LβCM5、5×10~(-4) mol/LβCM5+5×10~(-4) mol/L NaL。记录周采食量。每天灌喂两次,30天后宰杀大鼠,取十二指肠黏膜。RT-PCR法检测肠粘膜中SS和CCKmRNA表达的变化。结果显示:βCM7和βCM5组大鼠前两周的平均周采食量显著增加,第一周的平均周采食量分别提高了9.12%(P0.01)和8.26%(P0.01)。随着饲养时间的延长,βCM7的刺激采食作用逐渐减弱。灌喂βCM7和βCM5均能显著提高大鼠十二指肠黏膜中CCK mRNA表达量,极显著地降低肠黏膜中SS mRNA表达(抑制率分别为30.2%和23.0%);与βCM7和βCM5处理组相比,同时灌喂NaL能显著逆转βCMs对CCK和SS基因表达的影响。结果表明:βCMs调节大鼠短期采食。具有阿片样活性的βCMs对十二指肠黏膜CCK基因表达的促进效应不仅仅与内源性阿片肽系统有关,还与十二指肠黏膜中SS反馈调节有关。 6βCMs对小肠葡萄糖和氨基酸吸收的影响 本实验观察了βCMs对成年大鼠血糖和氨基酸水平及其对小肠葡萄糖和氨基酸吸收的影响。实验分为体内和体外两个部分。32只成年雄性SD大鼠随机分为4个处理组,分别灌喂1.5 mL生理盐水、2.5×10~(-4)mol/LβCM7、2.5×10~(-4)mol/LβCM5和0.5×10~(-4)mol/L Poly-Gly7(与βCM7的含氮量相同)。连续灌喂30天后宰杀大鼠,取血清,测定血清中葡萄糖和氨基酸含量。体外实验分别探讨0、62.5、125和250μg/mLβCM7对离体肠囊葡萄糖和氨基酸吸收的影响。将成年大鼠空肠中上段取出,制备成黏膜面外翻的肠囊,放入含有上述不同浓度的βCM7和葡萄糖、βCM7和氨基酸的培养液中,观察肠囊内葡萄糖和氨基酸含量的动态变化。结果显示:(1)连续灌喂βCM7极显著降低了成年大鼠血糖水平。βCM5对大鼠血糖也有下调作用,但差异不显著(P=0.076)。Poly-Gly组的大鼠血糖水平没有显著变化。不同浓度βCM7对离体肠囊葡萄糖的吸收具有抑制作用,其浓度越高抑制效应越强。βCM7能降低葡萄糖跨膜吸收早期的平均速率,从而抑制葡萄糖的吸收。(2)灌喂βCM7使成年大鼠血清中与糖原异生有关的Gln、Glu、Ala浓度显著升高。Poly-Gly和βCM5对血清中氨基酸水平并没有显著影响。250μg/mLβCM7抑制离体肠囊对氨基酸的吸收;62.5μg/mLβCM7也能抑制肠囊对Asp(P0.05)、Thr(P0.05)、Ala(P0.01)和Arg(P0.01)的吸收;而显著促进Ser、Gln、Gly、Tyr、Ile、Lys和Trp的吸收。从转运速率上分析,62.5μg/mLβCM7显著提高了各个氨基酸10.20min内的平均吸收速度,部分氨基酸(Glu、Ser、Arg、Met、Trp、Gly、Tyr,Phe和Ile)的吸收速度能持续升高到30min。上述结果表明,βCM7通过降低葡萄糖吸收的平均速度,抑制小肠对葡萄糖的吸收,从而影响了机体的血糖水平。βCM7对小肠氨基酸吸收的影响与其对氨基酸吸收早期的平均速度和刺激吸收的时间以及βCM7自身的浓度有关。与βCM5和Poly-Gly的结果相比,βCM7对大鼠血糖和氨基酸的影响与其肽结构序列有关。


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