不同氮效率水稻品种增硝营养的生理与分子生物学机制

【摘要】： 水稻是我国最重要的粮食作物，其种植面积和粮食产量为世界粮食种植面积和产量的22.8％和36.9％，稻谷产量占中国粮食总产的43.7％。传统条件下，水稻都是在淹水条件下生长，但水资源短缺已成全球面临的危机，我国农业用水占总用水量的80％，而水稻用水占农业用水的70％左右。调整种植业结构，压缩耗水较多的水稻栽培面积，推广节水灌溉是缓解水资源紧缺的有效途径。从营养学意义上讲，NH_4~+和NO_3~-是植物生长过程中主要的两种矿质氮源。淹水条件下硝化作用被强烈抑制，使土壤中的NH_4~+浓度大大增加，NH_4~+成为水稻田土壤N的主要存在形态，因此前人对水稻N营养的研究主要侧重在NH_4~+营养而忽略了对NO_3~-营养的研究。但我国目前逐渐兴起的水稻节水栽培技术使水稻根系的通气条件有了很大的改善，在较好的通气条件下，肥料N和土壤有机N矿化释放出的NH_4~+易被氧化成NO_3~-，在这种情况下，水稻则完全以硝营养为主。而且值得注意的是，水稻根系能分泌O_2，这些O_2能被土壤硝化微生物利用，从而将NH_4~+氧化成NO_3~-，在根表形成的NO_3~-立即被水稻吸收，因而通常从水稻土壤中采集的土样中较难测到NO_3~-或数量极微，但实际情况下，即便是完全淹水，水稻根系也是处于铵、硝混合营养中。 本论文在水培条件下研究了不同氮效率水稻的差异，从中筛选出对增硝营养响应差异大且氮效率差异大的水稻基因型；在此基础上研究不同氮效率基因型水稻对NO_3~-的吸收和生理利用过程，阐明水稻增硝营养的生理机制；丰富水稻氮营养理论，提出氮效率与增硝营养之间的关系，为氮高效水稻品种的选育提供理论依据。水培试验包括以后4部分：在南京农业大学江浦试验站在两个氮水平(0和180kg ha~(-1))下进行了的氮效率基因型评价，从中选出作为以后的供试材料；2003年研究了在不同铵硝配比条件下，本课题组从177个粳稻品种中筛选的8个氮效率差异较大的水稻基因型的生长情况，从中筛选出对增硝营养响应差异较大的品种作为以后的供试材料；2004年研究了氮高效水稻品种南光和氮低效水稻品种ELIO在全生育时期内对增硝营养的响应情况；2005年采用水培试验研究了两个品种苗期根系生长对增硝营养的生理响应，同时采用~(15)N示踪法研究了一个氮高效水稻(南光)和一个氮低效水稻(ELIO)在生育前期吸收NH_4~+和NO_3~-的动态变化；2006年采用~(15)N示踪法和定量PCR，研究了氮高效水稻南光和氮低效水稻ELIO在苗期对NH_4~+吸收动力学参数对增硝营养的响应及增硝营养对铵转运蛋白(OsAMT1；1-1；3)表达的影响。 主要结果如下： 1．利用控制条件下的水培试脸方法，研究了不同铵硝配比(NH_4~+／NO_3~-比例为100／0、75／25、50／50和25／75)营养条件对8种不同氮素利用效率水稻苗期生长的影响。结果表明：在增硝营养条件下，不同水稻品种对硝态氮(NO_3~-)的反应不同。与纯铵营养条件相比，增硝营养对大多数氮高效水稻品种的生长都有显著促进作用，而对氮低效品种的生长没有显著影响。重点分析了增硝营养对氮高效水稻品种南光和氮低效水稻品种ELIO生长的影响。研究发现，对于南光，增硝营养可以通过增加水稻叶片的光合速率，促进水稻的分蘖和生长，来增加水稻对氮素的吸收量，提高氮素利用率，而增硝营养对氮低效水稻ELIO的生长并无显著影响。NO_3~-的存在可增加干物质在水稻根系的积累，增加根系体积，促进水稻根系的生长。 2．通过添加硝化抑制剂(二氰胺，DCD)来控制硝化作用的水培试验方法，研究了氮高效水稻品种南光和氮低效水稻品种ELIO的籽粒产量对增硝营养(NH_4~+∶NO_3~-比例为100∶0和75∶25)的响应，同时从产量构成、不同生育时期水稻生长、氮素吸收和同化4个方面研究了造成其产量差异的生理机制。结果表明：增硝营养可以显著促进氮高效水稻品种南光的生长，从而使其籽粒产量水平分别提高了21％，而对氮低效水稻品种ELIO的籽粒产量没有显著影响。进一步分析表明：在增硝营养条件下，南光的穗粒数增加了25％，结实率增加了16％；而氮低效水稻品种ELIO的结实率和穗粒数在两种营养条件下没有显著变化；增硝营养可以促进南光对氮素的吸收，使其在苗期、分蘖盛期、齐穗期和成熟期对氮素的吸收量平均增加了36％，进而提高了其净光合速率，使其干物质积累量在四个生育时期平均增加了30％；南光叶片硝酸还原酶和根系谷氨酰胺合成酶的活力在增硝营养条件下分别增加了100％和95％，说明增硝营养促进了氮高效水稻品种南光对NH_4~+和NO_3~-的同化利用。与氮低效水稻品种(ELIO)相比，氮高效水稻品种(南光)对增硝营养表现出较强的生理响应。 3．与纯铵营养条件下的根系相比，在增硝营养条件下氮高效水稻品种南光和云粳38的根系干重和根系氮积累量在四个生育时期平均增加了32％和38％，而ELIO根系的干重和氮积累量均没有显著增加。苗期试验表明，与纯铵培养的水稻根系相比，增硝营养培养的南光根系的干重和氮积累量均显著增加，而且其根系的表面积和体积增幅均呈显著水平，而其根长却无明显增加。氮低效水稻品种ELIO的根系生长在两种营养条件下差异不显著。两个水稻品种根系的可溶性糖含量在不同氮形态处理下没有显著差异，说明增硝营养并不是通过调节根系可溶性糖含量来刺激侧根的生长。 4．利用~(15)N同位素标记技术，用~(15)N标记了~(15)NH_4~+的方法测定了氮高效水稻品种南光和氮低效水稻品种ELIO在苗期、分蘖初期和分蘖盛期的~(15)NH_4~+吸收量和吸收效率。研究结果表明，增硝营养不仅能够促进南光根系的生长，也能够促进其地上部的生长，其根系的生物量和氮积累量在三个生育时期平均增加了18％和31％，地上部的生物量和氮积累量在三个生育时期平均增加了18％和17％。增硝营养能够促进南光对~(15)NH_4~+的吸收效率，但对ELIO的吸~(15)NH_4~+效率没有显著影响，南光的根系和地上部在三个生育时期的吸~(15)NH_4~+效率平均增加了57％和46％。两个不同氮效率水稻品种均能够吸收大量的NO_3~-，其最大吸收量达到了吸氮总量的44％，且其吸NO_3~-量在分蘖盛期最高，苗期次之，分蘖盛期最少。 5．用~(15)N标记~(15)NH_4~+的方法研究了氮高效水稻品种南光和氮低效水稻品种ELIO苗期对~(15)NH_4~+的吸收动力学特征及增硝营养对其吸收特征的影响。研究结果表明：增硝营养可以促进南光对~(15)NH_4~+的吸收速率，进而提高其氮素利用效率，但对ELIO的~(15)NH_4~+的吸收速率没有影响。NO_3~-的存在促进了南光对NH_4~+的吸收，增加水稻吸收NH_4~+的V_(max)值(增加了14.1％)，而对其K_m值影响不大(增加了2.98％)，说明NO_3~-对NH_4~+吸收的影响主要在于影响NH_4~+载体的运转速率而非吸收位点与NH_4~+之间的亲和性。 6．采用实时荧光定量PCR技术，在转录水平上的定量分析了在纯铵和增硝营养条件下，氮高效水稻南光和氮低效水稻ELIO根系和叶片中的表达情况。研究结果表明，OsAMT1；1在南光和ELIO的根系和叶片中的表达量均较高，而OsAMT1；2和OsAMT1；3在南光和ELIO的根系的表达量也较高，但在叶片的表达量均较低。增硝营养能够促进OsAMT1；1、OsAMT1；2和OsAMT1；3在南光和ELIO根系中的表达，同时促进了OsAMT1；2在南光和ELIO叶片中的表达，但抑止了OsAMT1；3在南光和ELIO叶片的表达。OsAMT1；1在南光叶片的表达几乎没有变化，但在ELIO叶片的表达量的降幅达到了所有基因总表达量的10.3％。总的来说，在增硝营养条件下，OsAMT1s在南光的表达提高了14.5％，而在ELIO中仅提高了0.29％。这两个品种对增硝响应的不同主要是由于OsAMT1；1在叶片的表达对增硝营养的响应不同。