亚硝酸盐对蒸煮香肠品质的影响及其抑菌模型与机理的研究

【摘要】： 蒸煮香肠属于中低温西式肉制品，因其营养丰富、风味独特，深受消费者喜爱。硝酸盐和(或)亚硝酸盐是蒸煮香肠生产过程中最常用的食品添加剂，具有发色、抑菌、抗氧化、改善风味和质构等作用。由于亚硝酸盐具有毒性，同时作为前提物生成的N-亚硝基化合物具有致突变和致癌性，过量使用存在安全性问题；低温蒸煮香肠杀菌温度相对较低，货架期较短，易受腐败菌和致病菌的侵害，威胁消费者健康，其中肉毒梭菌属于革兰氏阳性菌，厌氧条件下产生的神经毒素可以导致严重的肌肉松弛和麻痹的肉毒毒素中毒，是肉类工业中危害最大的有害菌之一。本论文从低温肉制品安全性的两大主要问题入手，即添加剂安全(亚硝酸盐)和微生物安全(肉毒梭菌)，研究亚硝酸盐对蒸煮香肠腌制和冷藏过程中品质的影响，并通过亚硝酸盐对肉毒梭菌不产毒素的研究替代菌生孢梭菌抑制机理的初步研究，为后序亚硝酸盐替代物及N-亚硝基化合物抑制剂的深入研究提供理论依据；同时，应用预测微生物学方法，建立和验证蒸煮香肠中亚硝酸盐抑菌模型，以及不同试验条件下生孢梭菌孢子的热失活模型，以期更好的预测和控制低温肉制品中肉毒梭菌的生长和存活。具体研究内容和结果如下： 1．猪肉腌制过程中亚硝酸盐对其品质的影响 研究不同亚硝酸盐添加量(0、50、100和150 mg·kg~(-1))的猪肉在0～4℃温度下、0～48 h腌制时间中的品质变化，结果表明亚硝酸盐对猪肉腌制过程中的颜色、质构、新鲜度影响显著。其中颜色指标中的色差计CIE a~*值与感官评分、发色率、肌红蛋白总量之间的相关性较好(分别为r=0.91、r=0.92和r=0.72)，可以作为客观评价应用于实际生产；质构剖面分析(Texture Profile Analysis，TPA)显示随着腌制时间的增加，腌肉的硬度(Hardness)、胶黏性(Adhesiveness)、弹性(Springiness)和咀嚼性(Chewiness)增加，而粘聚性(Cohesiveness)和回复性(Resilience)减小，通过化学成分含量与质构指标的相关分析，表明水分含量与胶黏性、回复性和弹性的相关性较高(分别为r=0.891、r=-0.770和0.788)，是影响质构的主要因素，亚硝酸盐与弹性显著负相关(r=-0.808)，胶原蛋白含量与回复性显著正相关(r=0.740)；添加亚硝酸盐后，腌制猪肉的TBA值和TVBN值显著降低，脂氧化和蛋白败坏程度受到显著抑制。 2．蒸煮香肠冷藏过程中亚硝酸盐对其品质的影响 研究蒸煮香肠在0～4℃冷藏温度下，0～21 d贮藏时间内不同亚硝酸钠添加量(0、50、100和150 mg·kg~(-1))对其品质的影响。结果表明：水分、脂肪、蛋白质、胶原蛋白和亚硝酸盐在冷藏过程中都有降低趋势；感官评分表明添加亚硝酸钠的蒸煮香肠贮藏10 d的颜色、质构、风味和口感上都优于未添加的对照组；TPA指标中硬度和胶黏性在冷藏过程中增加，弹性、粘聚性和回复性减小，咀嚼性先增加后减小，通过基于亚硝酸盐残留量和TPA指标相关分析进行的主成分分析(principal component analysis，PCA)，亚硝酸盐主要影响包含硬度、弹性、粘聚性、胶黏性和回复性的主成分1(PC1)，其次是包含咀嚼性的主成分2(PC 2)，PC 1和PC 2的方差贡献率分别为65.09％和16.46％；应用顶空固相微萃取法(solid phase microextraction，SPME)结合气相色谱-质谱联用方法(gas chromatography／mass spectrometry，GC／MS)对蒸煮香肠冷藏10天的挥发性物质进行了分离和鉴定，添加亚硝酸盐后蒸煮香肠的风味种类增多，新检出的风味物质如乙醇、1-丁醇、(E)-2-己烯-1-醇、(E)-2-庚烯-1-醇、(E)-2-辛烯-1-醇、薄荷醇、3-甲基丁醛、己酸、松萜和4-硝基临苯二酰胺等加强了蒸煮香肠的腌肉风味(cured-meat flavor)；另外冷藏过程中蒸煮香肠的颜色和保水性变化不显著(P＜0.05)。 3．蒸煮香肠中亚硝酸盐抑菌模型的建立与验证 研究蒸煮香肠中亚硝酸盐抑制大肠杆菌、葡萄球菌和生孢梭菌生长的预测模型，并进行数学检验和验证。应用修正的Gompertz和Baranyi两种模型对接种后蒸煮香肠0～4℃冷藏温度下的生长曲线进行了拟合，两种模型拟合性较好(R~2＞0.75)，通过变异系数比较，采用Baranyi两种模型对特定菌生长曲线的参数生长率(μ_(max))和迟滞期(λ)进行了参数估计。应用Bělehrádek或Ratkowsky平方根经验模型拟合亚硝酸盐抑菌模型，拟合性良好(R~2＞0.65)，推知大肠杆菌、葡萄球菌和生孢梭菌可耐受的最高亚硝酸盐浓度分别为低于400、200和190 mg·kg~(-1)。应用市售香肠对建立的亚硝酸盐抑菌模型进行验证，并通过数学检验参数平方根误差(Root-Mean-Squares Error，RMSE)、准确性因子(Accuracy factor，A_f)、偏差因子(Bias factor，B_f)和标准预测误(Standard Error of Prediction，SEP)对模型进行数学检验，表明模型适用性、可靠性和拟合性在可接受范围内，可以推广使用。 4．生孢梭菌孢子热失活模型的建立与验证 研究不同温度(101～121℃)、pH值(4.5～6.5)和NaCl含量(2～6％)的试验条件下生孢梭菌孢子的热失活模型，并进行数学检验和验证。不同试验条件下的生孢梭菌孢子从10~(10) CFU·mL~(-1)下降至10~5 CFU·mL~(-1)的热失活曲线用Weibull频数模型进行了拟合，建立了一级失活预测模型(R~2＞0.90)；应用多元回归方法建立不同温度、pH值和NaCl含量影响下的失活参数δ和p的响应曲面二级失活预测模型(Response Surface Model，RSM)。对建立的二级预测模型另随机选择条件进行了验证．数学检验结果表明，建立的二级失活预测模型的标准预测误差(％SEP)和平方根误差(RMSE)较小，准确性因子(A_f)和偏差因子(B_f)在接受范围内(B_f＜1＜A_f)，预测模型能够较好的模拟不同试验条件对生孢梭菌孢子热失活的影响，在实际产品的验证检验后，可以推广使用。 5．亚硝酸盐对生孢梭菌超微结构、蛋白表达及铁硫蛋白活性的影响 主要从蛋白抑制角度研究亚硝酸盐对不产毒素的蛋白水解型肉毒梭菌的研究替代菌——生孢梭菌的抑制机理。在生孢梭菌对数生长期添加不同量的亚硝酸盐(0、100、200、300、400和500 mg·L~(-1))，收集亚硝酸盐作用约20 h的生孢梭菌细胞，发现生孢梭菌细胞产量显著降低，应用透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察发现，添加亚硝酸盐后生孢梭菌超微结构发生显著变化，如细胞壁破裂、变薄或消失，胞浆内容物溶解或流失等。同时，生孢梭菌菌液的蛋白浓度和蛋白表达受到一定影响，生孢梭菌铁硫蛋白中的铁氧还蛋白(Ferredoxin，Fd)和丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶(Pyruvate-Ferredoxin Oxidoreductase，PFO)的活性受到抑制显著，亚硝酸盐浓度从0到500 mg·L~(-1)，PFO活性从1.447降到了0.753 U·mL~(-1)，差异显著(P＜0.05)。亚硝酸盐对细菌铁硫蛋白的抑制是其主要抑菌机理之一。