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纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达

刘朔  
【摘要】: 纳豆激酶(Nattokinase,NK)是由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtillis var.natto)产生的一种具有较强溶栓功能的丝氨酸蛋白酶。国內外研究表明,该酶能显著溶解体內外血栓,明显缩短纤维蛋白的溶解时间,并具有激活静脉内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA),降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂(pAI-1)等功能。纳豆激酶的溶解血栓功效已得到广泛确证,但目前还没有能够得到很好推广利用,应用很有限,其原因是市场供给不足以及价格高。利用高效表达系统作为生物反应器,可低成本、规模化地大量生产纳豆激酶供更多人所用,无疑是解决这一问题的有效方法之一。 本研究应用基因工程和蛋白质工程技术获得具有自主知识产权的纳豆激酶高产工程菌,为纳豆激酶作为溶栓药物的进一步研制和开发应用提供理论依据和条件,主要工作包括以下內容: 1.从本课题组自主分离筛选的原生质体紫外诱变处理后产酶提高幅度最大的纳豆菌诱变株DU115和野生纳豆菌BN10基因组DNA中扩增纳豆激酶成熟肽基因nkD和nkB,构建重组表达载体pPICZα-A-nkD和pPICZα-A-nkB,DNA序列测定表明,nkD基因与nkB基因相比,有两处核苷酸发生了突变(A107G以及C396T),A107G碱基突变导致氨基酸的替代D36G(Asp→Gly)。将两重组表达载体经SscⅠ线性化后电击转化毕赤酵母X-33并实现了分泌表达,对表达产物进行分离纯化,酶活性测定及热稳定性检测。结果表明,纳豆激酶DNK与BNK在65℃处理15min,前者的热稳定性提高20%,比活力提高16.6%。对位点变化前后的纳豆激酶空间结构进行比较预测,由此可推断,第36位氨基酸残基的突变可能与其酶热稳定性及活性提高密切有关。综合考虑,选择纳豆菌DU115纳豆激酶基因作为下一步研究的材料。 2.在不改变纳豆激酶DNK氨基酸序列的基础上,优先选择毕赤酵母最偏爱的密码子,并参照原有纳豆菌DU115纳豆激酶基因的密码子使用情况,部分使用次偏好密码子,从而尽量消除mRNA稳定的二级结构,设计并合成了纳豆激酶成熟肽基因(synkD)。所合成的synkD全长为848 bp,克隆入pMD18-T载体上,测序结果表明与预期结果相一致。 3.将人工合成的纳豆激酶基因synkD克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-synkD,转化毕赤酵母X-33得到重组子,改造后的synkD表达水平比nkD高3.5倍。对重组蛋白的表达条件进行了优化,结果表明:当重组酵母菌在BMGY培养基中增殖至OD_(600)为5~6时,将菌体转入pH7.0的BMMY培养基中使菌体密度为OD值1.0,28℃诱导84 h,每24 h添加甲醇至终浓度为1.5%,优化后的纳豆激酶基因synkD摇瓶发酵表达量可达到112μg/mL,酶活性达到512 IU/mL。经十代传代实验证实重组转化子遗传稳定性良好。密码子优化后的纳豆激酶基因在毕赤酵母中的高效表达显示出了商业应用潜力。


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