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3,5-DNBA降解菌和生物膜形成菌对硝基芳香烃废水的生物强化处理研究

李蒙英  
【摘要】: 自然环境中能降解硝基芳香烃等异型生物质的微生物种类和数量很少,向污染水体投加有强降解能力的土著或外来野生型或基因工程茵的生物强化研究在实验室反应器中取得了一定的成功,但在实际废水处理中常因降解茵不易定殖而无法长期维持处理效果。本文研究了成膜力较强的细菌和降解茵混合培养的成膜特性,旨在探索促进降解细菌定殖于废水处理系统中的新策略. 一、硝基芳香烃降解茵的分离筛选及降解特性 以含多种硝基芳香烃的合成废水为进水设置反应器,投加长期受硝基芳香烃和其他化学品污染的环境样品,经敞开式大通量方法富集一段时间,从反应器中分离到一株3,5-二硝基苯甲酸(3,5-DNBA)降解菌株(A3);根据其形态特征、生理生化特征及16SrDNA同源性比较,初步鉴定为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni). 进一步研究了A3的降解特性与生物学特性,A3能以200mg/L 3,5-二硝基苯甲酸为唯一碳源,12h的降解率可达95%以上,24h可溶性有机碳(DOC)由72.5mgC/L降至10.2mgC/L,将3,5-二硝基苯甲酸降解矿化;A3以200mg/L 3,5-二硝基苯甲酸为唯一碳、氮源时将底物转化为一种黄色产物,培养液颜色在以后的几天中始终未消退,24h时DOC为56.5mgC/L,3,5-二硝基苯甲酸未完全降解;A3降解3,5-二硝基苯甲酸的适宜温度为20—30℃,适宜pH为5~9. 二、生物膜上细菌的分离鉴定及细菌生物学特性对生物膜形成贡献的评价 从废水处理系统、生活污水下水口等多处生物膜上共分离获得18株细菌,异位测定结果显示它们的生物膜形成能力有很大的差异,成膜力最强的与最弱的相差28倍,对其中有较强成膜力的7株细菌进行了鉴定,它们分别为Pseudomonas sp.M8、Pseudomonas putida M9、Aeromonas caviae M1O、Bacillus cereus M19、Pseudomonasplecoglossicida M21、Aeromonas hydrophila M22和C.testosterone A3;进一步测定了18株细菌可能与成膜力有关的5个生物学特性,采用相关分析和通径分析评估了这5个细茵生物学特性对生物膜形成的贡献,它们对生物膜形成影响的相对重要性依次为:胞外多糖鞭毛AHL群体感应信号分子胞外蛋白群游力。 三、2种功能菌株荧光蛋白基因的标记 为了了解降解菌和生物膜形成菌混合培养或投加到废水处理系统后2种菌在生物膜中的数量分布和A3定殖情况,对降解菌株A3和有较强成膜能力的M9和M22进行了荧光标记,采用三亲接合法和电转化法成功地将带有绿色荧光蛋白基因的质粒pTR102gtp转入了C.testosteroni A3、P.putida M9和A.AJdrophila M22菌株,将带有红色荧光蛋白基因的质粒pJZ402rfp转入了C.testosteroni A3。荧光检测显示,细菌个体和群落都显示出明亮的绿色或红色荧光。 四、不同生物膜形成菌对降解菌定殖的影响 将有较强成膜能力的5株细菌与降解菌组合,研究了降解菌株A3分别与5株成膜力较强的菌株M8、M9、M19、M21和M22混合培养时的降解能力、生物膜形成量和生物膜抗冲击能力等指标,结果显示混合培养时的生物膜形成量是降解菌A3单独培养的1.76~5.95倍,其中M9和M22与A3混合培养不但促进了生物膜的大量形成且生物膜附着牢固,培养24h形成的双菌生物膜比A3单菌和其他3种双菌生物膜表现出更强的抗3,5-二硝基苯甲酸冲击能力,每次更换合成废水6h后3,5-二硝基苯甲酸降解率即分别达63.3~91.6%和70.7~89.4%;连续冲击前后A3M9和A3M22双菌生物膜中的总菌数和A3菌数比A3单菌和其他3种双菌生物膜高2~3个数量级,M9和M22促进了降解菌在生物膜中的定殖,说明某些生物膜形成菌强化降解菌固定于生物膜中的这种自固定作用可能会促使处理系统保持更持久稳定的降解能力。 五、不同营养条件对生物膜形成影响的研究 研究了不同营养物对A3与M9和A3与M22混合培养的影响,表明3,5-二硝基苯甲酸基础盐合成废水(DCMM)中添加不同浓度的LB培养液对反应系统降解3,5-二硝基苯甲酸的降解效率没有显著影响,但容易被细菌利用的LB培养液含量的增加对生物膜形成量有很强的促进作用;用流式细胞仪测定了A3与P.putida M9(pTR102gfp)和A3与A.Aydrophila M22(pTR102gfp)在不同营养条件下混合培养时2种功能菌的比例,随DCMM中LB培养液含量从0%增加至5%生物膜上P.putida M9(pTR102gfp)和A.AyJrophila M22(pTR102gfp)所占的比例分别从43.8%增加至82.3%和从39.2%增加至79.6%。 采用激光共聚焦显微镜观察了A3M9gfp和A3rfpM22gfp生物膜结构和生物膜中2种菌的数量分布情况,生物膜三维结构显示A3被均匀地固定于生物膜内部;从生物膜形成量、生物膜中降解菌数和生物膜质量综合评价添加2%LB的DCMM合成废水中不但能形成较大量的生物膜,固定于生物膜中的降解菌数量也较高;实验室条件下对2种功能菌混合培养形成生物膜情况的研究结果对实际废水处理中调节废水营养成分强化降解菌定殖具有一定的指导意义。 六、生物膜法废水处理中2种功能菌的生物强化作用 具有较强成膜力的细菌如能促进降解菌定殖于生物膜内,使其通过自固定作用固定于载体表面,将有可能长期保持生物强化降解效果。采用8L反应器测定了2种功能菌在生物接触氧化工艺中的生物强化作用,结果显示投加A3和M9的1号反应器和投加A3的2号反应器能在24h内快速降解3,5-二硝基苯甲酸,并且在以后35d的运行过程中保持了良好的降解效果,DCMM选择平板培养和DGGE检测结果都证明反应器内生物膜中有降解菌A3的存在;只接种城市污水处理厂活性污泥的3号反应器在前2周的运行过程中基本不降解3,5-二硝基苯甲酸,但15d后降解率快速增加,21d后对3,5-二硝基苯甲酸的降解效果与1号和2号反应器无明显差异,3号反应器生物膜的DGGE图谱中未发现与A3菌株相似的条带,说明土著微生物经2~3周的驯化也可降解3,5-二硝基苯甲酸;运行35d时未投加生物膜形成菌株M9的2个反应器生物膜DGGE图谱中也发现与M9菌株相似的条带,说明M9可能存在于接种污泥或反应器运行环境中并且容易形成生物膜。


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