收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

三种Ⅲ型蛋白影响黄单胞菌—水稻互作与植物抗病性研究

刘红霞  
【摘要】: 利用24个已知抗病基因的近等基因系材料对我国285个水稻白叶枯菌株的毒性进行了研究。除了IRBB51以外,含有多个抗病基因的水稻品种几乎对所有菌株都表现了高度的抗性。因此,我们选出对白叶枯菌株抗感反应有明显差异的13个含有单个抗病基因的水稻品种用于进一步的实验。IR24和IRBB10抗性很弱,仅对少数菌株具有抗性;而IRBB5、IRBB7以及IRBB21则具有较高的抗性,对大多数菌株表现出高度的抗性。其它单基因品种如IRBB2、IRBB3、IRBB4、IRBB7、IRBB13等在菌株间的抗感反应有着显著的差异。因此,根据白叶枯病菌与近等基因系水稻之间的互作,我们筛选出6个单基因品种(IRBB5,IRBB13,IRBB3,IRBB14,IRBB2,IR24)作为鉴别品种,从而将我国的白叶枯病菌菌株划分为9个小种,其互作模式依次为:RRRRRR、RRRRRS、RRRRSS、RRRSSS、RRSSSS、RSRRRS、RSSRRS、RSSSSS、SSSSSS,对应小种频率分别为10.18%、10.53%、4.91%、10.18%、24.21%、5.96%、11.23%、22.46%、0.35%。我国白叶枯菌株的毒性呈现多样性,不同时期、不同地区菌株毒性差异明显。与菲律宾菌株的毒性进行比较,也存在较大的差异。 通过构建Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99的hrpA、hrpF基因突变菌株PXO99/PMD-A(AOS)、PXO99/PMD-F(FOS)及其功能互补菌株AOS/pUFR034∷hrpA(cAOS)、FOS/pUFR034∷hrpF(cFOS),并分别对之进行GFP荧光标记,产生PXO99/pHM1∷gfp(PXO99-GFP)、AOS/pHM1∷gfp(AOS-GFP)、FOS/pHM1∷gfp(FOS-GFP)、AOS/pHM1∷hrpA∷gfp(cAOS-GFP)、FOS/pHM1∷hrpF∷gfp(cFOS-GFP),对水稻-白叶枯病菌互作进行研究。用PXO99、AOS、FOS、cAOS、cFOS、PXO99-GFP、AOS-GFP、FOS-GFP、cAOS-GFP、cFOS-GFP分别处理水稻及烟草。GFP标记菌株与非GFP标记菌株对水稻的致病性及在烟草上形成HR的能力没有明显差别。突变体FOS对水稻的致病性减弱,AOS几乎完全丧失了对水稻的致病性,形成褐斑。FOS仍然具有诱导烟草形成HR的能力,而AOS同时丧失了在烟草上形成HR的能力。功能互补菌株cAOS、cFOS对水稻的致病性比突变体有所恢复,但达不到野生型的水平。cAOS不能恢复AOS在烟草上形成HR的能力,cFOS仍然可诱导烟草叶片形成HR。病原菌喷雾处理水稻叶片的荧光观察显示,野生型菌株、功能互补菌株、突变体FOS-GFP通过伤口及自然孔口形成侵染,而突变体AOS不能形成侵染。电镜观察结果表明,野生型菌株多数以聚集的方式吸附在自然孔口周围,而突变菌株AOS则多数以分散的形式吸附于水稻叶片表面。以上结果显示,hrpA的突变可能对菌株的识别及聚集能力产生了影响,从而影响了菌株的侵染。 已有研究试图确定harpins在植物细胞中的作用部位。但对不同的harpins如来自Erwinia amylovora的HrpN_(Ea)、Pseudomonas syringae pv.phaseolicola的HrpN_(Psph)等研究结果都不尽相同。因此,harpins的识别部位、结合受体等一直不清楚,在本研究中,作者利用荧光蛋白标记构建融合蛋白,以便今后进一步研究HrpA、HrpF在水稻上的作用部位。HrpA_(Xoo)、HrpF_(Xoo)和HrpA_(Xooc)、HrpF_(Xooc)分别是由水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的hrpA、hrpF基因编码产生的蛋白质。从水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌中分别克隆hrpA和hrpF基因,与gfp(green fluorescent protein)构建融合基因,连接pET30a(+)载体,获得了重组质粒pET30a(+)∷hrpA_(Xoo)∷gfp、pET30a(+)∷hrpA_(Xooc)∷gfp、pET30a(+)∷hrpF_(Xoo)∷gfp和pET30a(+)∷hrpF_(Xooc)∷gfp,转化宿主菌BL21(DE3)产生表达菌株pAGGE、pARGE、pFGGK和pFRGK。表达菌株经IPTG诱导培养,收集菌体,超声波破碎后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,分别产生94.6 kD、94.8 kD、116.3 kD、116.3 kD大小的组氨酸标记的目的蛋白质与GFP的融合蛋白条带。 水稻细菌性条斑病菌HpaG_(Xooc)蛋白质作为harpin效应分子可促进植物生长、诱导过敏性细胞死亡、诱导植物对病原菌的抗病性。其编码基因hpaG_(Xooc)包含两个富含甘氨酸的结构域(glycine-rich motif,GRM)和一个半胱氨酸(cysteine)。GRM是harpin类蛋白的共同特征,而一般harpin类蛋白结构中则不含有半胱氨酸。我们对hpaG_(Xooc)的GRM进行了缺失突变得到突变体hpaG_(Xooc)MG(MG),对hpaG_(Xooc)的半胱氨酸位点进行定点突变,将其半胱氨酸突变成苏氨酸得到突变体hpaG_(Xooc)C47T(C47T)。hpaG_(Xooc)、MG、C47T经体外表达得到HpaG_(Xooc)、MG和C47T。用它们分别处理烟草,MG和C47T诱导烟草产生的死亡细胞数目分别是HpaG_(Xooc)的1.7和1.2倍;标记基因hin1、hsr203的表达结果与之一致。MG和C47T处理的植株的抗病性也明显增强。以HpaG_(Xooc)、MG、C47T处理的烟草再接种病斑TMV病毒,5天后调查,三种蛋白处理的植株叶片病斑分别减少了58%、92%、81%;以Pseudomonas syringae pv.tomato(DC3000)接种番茄,5天内对病原菌进行持续分离,统计其细胞数目。经HpaG_(Xooc)、MG、C47T处理的番茄上的病原菌的数目分别约为对照的1/160、1/15860、1/1260。防卫相关基因Chia5、NPR1、PR-1a的表达结果与之一致。HpaG_(Xooc)、MG和C47T还可促进番茄生长,地上部分的增长幅度分别为15%、46%、125%、;地下部分的增长幅度分别为53%、106%、77%。细胞延展与生长相关基因EXP2的表达情况与之一致。这些结果说明HpaG_(Xooc)中富含甘氨酸的区域以及半胱氨酸的存在抑制了蛋白本身对植物的效应。 HpaG_(Xooc)、HrpF_(Xooc)、HrpA_(Xooc)作为水稻细菌性条斑病菌的Ⅲ型蛋白,与病原菌的致病性密切相关。HpaG_(Xooc)作为效应分子,HrpF_(Xooc)参与病原菌Ⅲ型泌出系统通过寄主植物的转运结构的形成。HrpA_(Xooc)可能参与病原菌Ⅲ型泌出系统的泌出结构的形成。三者之间是否存在某种关系呢?通过酵母双杂交系统探讨Ⅲ型蛋白HrpAXooc、HrpFXooc与HpaGXooc之间的关系。分别构建AD载体pGADT7∷hrpA_(Xooc)、pGADT7∷hrpF_(Xooc)和DNA-BD载体pGBKT7∷hpaG_(Xooc)、pGBKT7∷MG、pGBKT7∷C47T。AD载体与DNA-BD载体共转化酵母菌株Y190,β-Galactosidase Assays显色表明,HrpA_(Xooc)、HrpF_(Xooc)与HpaG_(Xooc)、MG、C47T之间不存在直接的互作。 本研究的创新点:(1)通过突变体阐释Ⅲ型蛋白HrpA和HrpF在水稻-黄单胞菌互作中的功能;(2)通过对HpaG_(Xooc)的结构的改变,明确Ⅲ型效应子HpaG_(Xooc)的关键结构特征对其植物效应的影响;(3)通过酵母双杂交系统探讨Ⅲ型蛋白HrpA_(Xooc)、HrpF_(Xooc)与HpaG_(Xooc)之间的关系。 本研究的缺点:有些地方文字描述不够准确,个别地方缺乏统计数据。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 何俊瑜;任艳芳;朱诚期;蒋德安;;镉胁迫对镉敏感水稻突变体活性氧代谢及抗氧化酶活性的影响[J];生态环境;2008年03期
2 曾斌;赵鹂;朱诚;孙宗修;;水稻突变体对土壤汞胁迫耐性机理的初步研究[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2008年01期
3 王小艳;王教瑜;姜华;王艳丽;张震;柴荣耀;毛雪琴;邱海萍;杜新法;孙国昌;;稻瘟病菌对新型模式植物二穗短柄草的致病性研究[J];中国水稻科学;2011年03期
4 李爱贞;罗宽;刘毅君;;水稻近等基因系与白叶枯病菌互作的生理指标研究[J];植物保护学报;1999年01期
5 查冬兴,唐纪良;转座子报告基因Tn5gusA5诱变甘蓝黑腐病菌分离与致病相关的突变体[J];广西农业生物科学;1996年01期
6 周玮;张荣铣;李瑞;钟亮;陆巍;;不同甲基紫精诱导离体水稻叶片氧化胁迫方法的研究[J];安徽农业科学;2007年32期
7 郑亚妮;张英利;朱艳;韩帅;李红玉;;野生型油菜黄单胞菌的过氧化氢释放特性[J];西北植物学报;2009年08期
8 张智慧;聂燕芳;何磊;李云锋;王振中;;外源茉莉酸甲酯诱导水稻抗瘟性相关防御酶和内源水杨酸的变化[J];植物病理学报;2010年04期
9 杨万风;陈磊;刘红霞;胡白石;刘凤权;;水稻条斑病菌gacA基因的克隆及功能初析[J];微生物学报;2007年02期
10 陈磊;韩志成;王晨;杨万风;钱国良;胡白石;刘凤权;;水稻白叶枯病菌hisF基因的克隆及功能初析[J];南京农业大学学报;2009年04期
11 王迪;傅彬英;张立军;;半定量RT-PCR方法研究microRNA393在旱处理后的孕穗期水稻叶片和穗部的表达情况[J];分子植物育种;2008年02期
12 史建荣,王裕中,陈怀谷,胡玉山;江苏省油菜菌核病菌与油菜品种的互作研究[J];江苏农业学报;1999年02期
13 王俊丽,聂国兴,李春喜,李娇;离子互作对木聚糖酶活性影响的研究[J];粮食与饲料工业;2004年03期
14 郭天财,马冬云,朱云集,王晨阳,夏国军,罗毅;冬播小麦品种主要品质性状的基因型与环境及其互作效应分析[J];中国农业科学;2004年07期
15 米国华,张福锁,王震宇;小麦超高产生理基础探讨──小麦后期碳氮代谢互作与粒重形成[J];中国农业大学学报;1997年05期
16 马文广,李永平,王晓云,金华,王颖宽;烤烟品种(系)经济性状与环境互作适应性分析[J];云南农业大学学报;2003年01期
17 王绍华,曹卫星,丁艳锋,田永超,姜东;水氮互作对水稻氮吸收与利用的影响[J];中国农业科学;2004年04期
18 王维源;;水稻标准叶色卡 崭新一代的稻叶比色工具[J];今日科技;1989年03期
19 曾浙荣,李英婵,孙芳华,王光瑞,周桂英,庞家智,林晓曼,黎建华,石秀玉,鲍思敬,武芝霞;37个小麦品种面包烘烤品质的评价和聚类分析[J];作物学报;1994年06期
20 金正勋,孙艳丽,李卓夫,李桂芳,赵西华,阎文义;小麦杂种后代籽粒蛋白质含量的配合力研究[J];作物学报;1996年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭士伟;王永飞;马三梅;;一个水稻叶片白化转绿叶突变体的遗传分析和精细定位[A];2010中国作物学会学术年会论文摘要集[C];2010年
2 胡荣华;蔡美玲;马洪丽;张娟;张书标;;水稻矮秆斑马叶突变体的遗传分析及基因定位[A];全国植物分子育种研讨会摘要集[C];2009年
3 杨娟;许云鹤;陈功友;;稻黄单胞菌xopX基因在致病性中的作用[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年
4 周红;王国力;黄培堂;黄翠芬;;组织型纤溶酶原激活剂新型突变体的分子设计及其生物活性的初步分析[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(上册)[C];1999年
5 刘婧;张方;王宝山;陈凡;谢先芝;;水稻光敏色素B缺陷型突变体具有较强的干旱胁迫耐性[A];植物分子生物学与现代农业——全国植物生物学研讨会论文摘要集[C];2010年
6 孙璐;文欣;谭英;李贺阳;赵月芳;牛聪伟;席真;;原卟啉原氧化酶及其突变体的酶学性质研究[A];中国化学会第26届学术年会化学生物分会场论文集[C];2008年
7 万崎;章晚联;陈新文;;丙型肝炎病毒E2糖蛋白糖基化突变体的研究[A];中国蛋白质组学首届学术大会论文摘要集[C];2003年
8 周静;张国珍;彭友良;;稻瘟病菌一个菌落生长缓慢突变体的研究[A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C];2004年
9 金卫;;水稻长护颖突变体初步研究[A];全国作物生物技术与诱变技术学术研讨会论文摘要集[C];2005年
10 朱传凤;吴家和;何朝族;;一个水稻半矮秆突变体的鉴定及其分子功能研究[A];全国植物分子育种研讨会摘要集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘红霞;三种Ⅲ型蛋白影响黄单胞菌—水稻互作与植物抗病性研究[D];南京农业大学;2006年
2 李欣;植物病原细菌中内源过氧化氢的产生、功能及其在与植物互作中的作用[D];兰州大学;2007年
3 严松;两个水稻卷叶基因的精细定位和克隆[D];扬州大学;2008年
4 刘怀华;玉米异交不亲和基因Ga1-S的遗传定位及其过程的转录组和蛋白质组分析[D];山东农业大学;2011年
5 王保;水稻OsARGOS基因的分离和功能分析[D];山东农业大学;2006年
6 霍胜楠;水稻胚胎发生相关基因的表达及其功能鉴定[D];山东农业大学;2008年
7 李金文;基于水稻叶片生理生态学特征的氮营养诊断[D];浙江大学;2010年
8 袁斌;OsMPK6双向调控水稻抗病反应[D];华中农业大学;2007年
9 宋亚玲;水稻OsIAA和OsGSK基因家族系统分析和OsIAA1基因功能鉴定[D];华中农业大学;2009年
10 马燕斌;小麦和玉米中光敏色素A基因的克隆与功能分析[D];四川农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高艳红;水稻卷叶性状的遗传分析及QTL的初步定位[D];南京农业大学;2006年
2 胡芳辉;稻瘟菌定殖与扩展过程中特异表达基因分析[D];福建农林大学;2009年
3 杨晓东;水稻叶片姿态对光抑制及衰老进程调节效应的研究[D];扬州大学;2009年
4 陈静;稻种资源耐冷性鉴定及水稻逆境反应基因OsNADPH1的克隆[D];四川农业大学;2006年
5 朱傅赟;高温下水稻PSⅡ和光合关键酶的动态研究[D];浙江大学;2007年
6 姚庆;重组表达稻瘟菌激发子对水稻油菜生长和抗性的影响[D];西南大学;2007年
7 范云峰;干旱和强光胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的影响[D];扬州大学;2007年
8 傅泰露;水稻不同生育期的耐冷性及鉴定指标的筛选[D];四川农业大学;2008年
9 田红琳;密度、邻体和综合效应对水稻大小不整齐性的影响研究[D];西南大学;2009年
10 陈浩;水稻U-Box蛋白质在不同发育时期的表达分析[D];河北农业大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 方圆;水稻叶片发黄、发白、有红褐斑主要由生理性因素引起[N];江苏农业科技报;2010年
2 方圆;近期低温造成水稻叶片发黄[N];江苏农业科技报;2010年
3 记者 李天舒;玉米中可提取抗艾物质[N];健康报;2010年
4 记者  龙军;杂交稻种子鉴定找到新方法[N];光明日报;2006年
5 记者 朱兴忠;甘州重离子束选育玉米新品种获突破[N];张掖日报;2008年
6 张学全;我国科学家完成3种病原微生物基因组测序[N];中国高新技术产业导报;2001年
7 江南雪舞;病毒“善变”[N];大众卫生报;2005年
8 记者 张学全;叩开大规模基因组测序之门[N];新华每日电讯;2001年
9 胡必强记者 赵凤华;我科学家发现水稻黄绿叶突变基因[N];科技日报;2007年
10 申淳;我国发现水稻黄绿叶突变基因[N];中国知识产权报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978