胺苯磺隆降解菌SW4的分离、降解途径及其应用研究

【摘要】：胺苯磺隆(Ethametsulfuron-Methyl)是美国杜邦公司成功开发的新型磺酰脲类除草剂。它具有杀草谱广、活性高、选择性强、价格低廉等优点,但在自然条件下很难快速降解,使得其在环境中的残留对后茬作物及水生生态环境具有潜在的威胁。农药残留微生物修复技术具有高效、无毒、无二次污染的特点,而且经济实用、操作简便,目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。 本文以南京菜园黄棕壤为研究材料,从土壤可培养微生物及土壤酶活性两个方面探讨了除草剂胺苯磺隆对旱地土壤微生物的影响及其毒性效应。并运用富集驯化的方法从长期受胺苯磺隆污染的土壤中分离到了三株对胺苯磺隆具有较高降解能力的细菌,并对这三株细菌进行了鉴定,对其中降解能力最高的菌株SW4更是研究了其生长特性和对胺苯磺隆的降解特性,对于SW4降解胺苯磺隆过程中产生的代谢物进行了鉴定,并在此基础上推断了胺苯磺隆在SW4作用下的代谢途径。进一步研究了SW4的粗酶液对于胺苯磺隆的降解及其影响因素。此外还在实验室内模拟田间环境,建立了水体和土壤中低浓度胺苯磺隆的生物检测技术,并运用此技术研究了降解菌剂SW4在水体和土壤中对低浓度胺苯磺隆残留的降解效果。本试验结果为建立有效的胺苯磺隆污染预警指标体系、环境质量评价和胺苯磺隆降解菌剂的有效利用提供了有益的参考。本研究所获的主要结论如下: 采用传统平板培养方法研究了胺苯磺隆对菜园黄棕壤好气性细菌、放线菌、真菌和固氮菌数量的影响及对土壤脲酶、脱氢酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶和土壤呼吸强度的影响。研究结果表明,只有高浓度的胺苯磺隆才表现出对土壤细菌的抑制,而且这种抑制作用在4周后就可以解除。胺苯磺隆能刺激真菌的数量,特别是在施药后1周时刺激作用显著。胺苯磺隆对放线菌具有强烈的抑制作用,即使是正常施用量(即10μg kg~(-1)干土),抑制率也达到了极显著水平;在处理30d的时候,只有低浓度处理土壤的放线菌数量得到恢复,其余的土壤仍处于被抑制状态。从毒理学角度来说,正常使用量的胺苯磺隆对放线菌的影响是短期的,但是随着浓度的增加,潜在的威胁就增大。该除草剂对固氮菌有强烈的抑制作用。总的来说,胺苯磺隆以正常田间施用量(10μg kg~(-1)干土)施用时,没有观察到对土壤中可培养的细菌和真菌具有实质性危害,对放线菌和好气性固氮菌有一定的影响。 土壤酶学研究结果表明:胺苯磺隆低于正常使用剂量(10μg kg~(-1)干土)时在初期(7d)能显著抑制土壤脲酶,而高剂量组则是先刺激后抑制。而土壤中过氧化氢酶活性在低剂量时先刺激后抑制,而高剂量则始终处于抑制状态。土壤脱氢酶对胺苯磺隆的反应总体上表现为先轻微抑制(7d),随后(14d)具有刺激作用,最后恢复(50d)。酸性磷酸酶与土壤蔗糖酶在各个剂量水平上都处于被抑制状态上,而且在第7d两者的抑制率都与胺苯磺隆的剂量呈很好的logister回归关系。 从胺苯磺隆除草剂生产企业生产车间表层泥土中分离筛选到三株对胺苯磺隆具有较高降解效率的细菌,编号分别为SW1、SW2、SW4,均能以胺苯磺隆为唯一氮源但不能作为唯一碳源生长。经培养特征、生理生化特征、16s rRNA基因系统发育分析表明SW1和SW4属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.),SW2属于节杆菌属(Arthrobacte sp.)。进一步将其中降解效率最好的菌株SW4与相近的模式菌株进行DNA-DNA同源性分析,发现菌株SW4与模式菌株Pseudomonas nitroreducens IAM1439的同源性达到93.79%,因此将这一菌株命名为Pseudomonas nitroreducens SW4。SW4对复合磺胺、氨苄青霉素、头孢他啶、及链霉素具有很好的抗性。SW4对胺苯磺隆的降解效率最好,一周内对100mg L~(-1)胺苯磺隆的降解率可以达到84.6%,而且在500 mg L~(-1)胺苯磺隆的M9培养基上菌落周围可以形成肉眼可见的透明圈。 对胺苯磺隆降解菌株Pseudomonas nitroreducens SW4的生长特性与降解特性作了详细的研究。发现SW4在C/N 2-8范围内生长都较好,以C/N 8生长最好,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为有机氮,其中有机氮以蛋白胨为最好。通过对其他磺酰脲类除草剂的降解谱试验后发现,SW4可以利用胺苯磺隆、烟嘧磺隆、吡嘧磺隆、甲磺隆、噻磺隆、为唯一氮源生长,却不能利用苯磺隆、氯磺隆、氯嘧磺隆。SW4的最适生长温度为30℃,最适pH为8,菌株生长与装液量成负相关。静息细胞在25℃时对胺苯磺隆降解效果最好,温度过高或过低都会显著影响降解效果。静息细胞在pH值6-10范围内对胺苯磺隆都有很好的降解效果,环境pH＜5时显著抑制静息细胞的降解活性。 运用HPLC和LC-MS的手段分析了菌株SW4在以胺苯磺隆为唯一氮源的液体培养基中代谢胺苯磺隆时产生的代谢物,在对代谢物结构的分析基础上推测了SW4降解胺苯磺隆的途径,结果表明SW4降解胺苯磺隆时存在两条代谢途径,其中一条为胺苯磺隆的脲桥断裂;另一条为胺苯磺隆的三嗪环侧链发生N-脱甲基作用,生成N-脱甲基胺苯磺隆,继而发生O-脱乙基作用,生成N-脱甲基-O-脱乙基胺苯磺隆,最后发生三嗪环的开环及其他作用后生成了methyl 2-[[[[[amino[(aminocarbonyl)imino]methyl]amino]carbonyl]amino]sulfonyl]benzoate。 以反应前后胺苯磺隆降低量为依据,建立了菌株SW4胺苯磺隆水解酶粗酶酶促反应体系,酶的定域试验表明该酶存在于菌株SW4的细胞膜内,不受底物胺苯磺隆的诱导。该酶的最适反应pH为8.0,最适反应温度为37℃,稳定性试验表明该酶在pH7.0时最稳定,在pH＜4.0或pH＞10.0时都不稳定,容易失活;温度越高,酶越容易失活,当温度高于30℃时酶的稳定性明显下降,温度高于50℃时酶活力在3h内完全丧失。金属离子中1mM的Hg~(2+)、Cu~(2+)对酶活有显著的抑制效应,Mg~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(3+)、Li~+对酶活有促进作用;SDS显著抑制胺苯磺隆水解酶活,1mM的金属螯合剂EDTA对酶活没有影响,但是当其浓度提高到10mM时对胺苯磺隆水解酶产生强烈的抑制效应,抑制率达到42.8%。 对于低浓度的胺苯磺隆残留可以应用敏感植物-玉米鲜根重测试。对于水体样品采用砂培4d后的玉米根鲜重测定,其回归方程为y=4.1399+0.9694x,R=0.9902。对于土壤样品可以采月土培15d后的玉米根鲜重测定,其回归方程为y=3.8692+1.4437x,R=0.9687。 SW4在降解土壤中高浓度的胺苯磺隆时,其降解作用主要发生在接种后15d内,土著微生物与SW4的联合降解要高于它们单独降解胺苯磺隆的能力。增加土壤有机碳含量以及中性或弱碱性土壤pH可以促进SW4对胺苯磺隆的降解,适当的土壤含水量对SW4降解胺苯磺隆也很重要,含水量过低(＜5%)或淹水条件都会显著降低其降解性能。