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豚鼠精子获能和超激活运动机理的研究

黄静燕  
【摘要】: 本试验的目的是研究Ca~(2+)和HCO_3~-调节豚鼠精子体外获能、超激活运动和蛋白酪氨酸磷酸化的信号机制。 1 cAMP促效物对豚鼠精子获能、超激活运动和蛋白酪氨酸磷酸化的作用 将豚鼠精子分别于TALP、缺Ca~(2+)的TALP、缺HCO_3~-的TALP及分别加有cAMP促效物(1mM dbcAMP和100μM IBMX)的培养液中孵育。取出不同孵育时间段的精子,分析超激活运动精子和获能精子的百分率以及蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化情况。用金霉素(CTC)染色法检测精子获能情况,结果显示,缺Ca~(2+)或HCO_3~-的TALP培养液显著抑制了超激活运动和获能精子的百分率(p0.01);在缺HCO_3~-的培养液中加入1mMdbcAMP和100μM IBMX显著提高了超激活运动精子和获能精子的百分率,并恢复到了正常培养下的水平;在缺Ca~(2+)的培养液中加入1mM dbcAMP和100μM IBMX虽然也提高了超激活运动和获能精子的百分率但是与正常水平比较还有显著差异(P0.01)。Western blotting检测蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化,结果显示,缺Ca~(2+)或HCO_3~-的TALP培养液抑制了蛋白酪氨酸磷酸化水平的增加;加入dbcAMP和IBMX提高了这两种情况下的蛋白酪氨酸磷酸化水平,孵育7h时蛋白酪氨酸磷酸化水平提高到了正常培养水平。 2 PKA抑制剂对豚鼠精子获能、超激活运动和蛋白酪氨酸磷酸化的影响 将豚鼠精子分别于TALP及含有不同浓度的PKA特异性抑制剂H-89(0.1、1、3、5、10μM)的TALP培养液中孵育7h。分析精子获能、超激活运动及蛋白酪氨酸磷酸化水平。用金霉素(CTC)染色法检测精子获能情况,Western blotting检测蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化情况。结果显示,与对照组比较(TALP培养液),H-89显著抑制了精子超激活运动和获能,并且这种抑制作用呈浓度依赖性;0.1μM的H-89降低了80、45、40kDa三种蛋白的酪氨酸磷酸化水平,在1μM的H-89作用下仅检测到40kDa的酪氨酸磷酸化蛋白,更高浓度的H-89完全抑制了蛋白的酪氨酸磷酸化。 根据以上结果推测,Ca~(2+)和HCO_3~-通过cAMP/PKA调节精子获能、超激活运动和蛋白酪氨酸磷酸化,并进一步证明了蛋白酪氨酸磷酸化与精子获能和超激活运动相关;除了这条途径,Ca~(2+)还可能通过其他的信号途径调节精子获能和超激活运动,因为缺Ca~(2+)情况下加入cAMP促效物并没有使精子获能和超激活运动恢复到正常水平。


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