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水稻OsPT2和OsPT6在异源表达系统中的功能鉴定

郭强  
【摘要】: 磷是植物生长发育必需的大量元素之一。它是植物细胞结构物质的组成成分,存在于磷脂、核酸和核蛋白中,在遗传信息的传递和细胞结构的维持中起到重要作用。土壤中有效磷浓度通常在10μM以下,而植物细胞的有效磷浓度则在100-2000μM范围。因此,土壤有效磷的供应状况和植物对磷素营养的吸收能力便成为限制植物生长发育的决定因素之一,研究植物吸收、利用磷素的分子生物学基础对提高植物的磷效率具有重要意义。 高等植物对磷素的吸收有两大系统:低亲和系统(Low-Affinity System)和高亲和系统(High-Affinity System)。迄今为止,在植物中克隆的磷转运蛋白基因基本上归属于Pht1和Pht2两大家族。根据对磷转运蛋白基因序列相似性和转录分析,推断水稻中含有13个Pht1家族成员,用于从土壤溶液中(包括水稻的菌根菌丝体)吸收磷以及植物体内磷的运输,其中磷转运蛋白基因OsPT2和OsPT6是Pht1家族中两个在缺磷和低磷诱导下强烈表达的基因。本研究选取OsPT2和OsPT6进行定位鉴定和功能分析。 1、采用半定量RT-PCR法检测水稻Pht1家族的各个成员在缺磷与供磷处理21天后组织特异性和时空表达特征,结果表明:OsPT3、OsPT8等为组成型表达,不受磷水平的诱导和限制,而OsPT1、OsPT2、OsPT6、OsPT7等是在根部受低磷水平诱导表达,其中OsPT2和OsPT6诱导表达最为强烈。 2、对野生型(WT)、突变体MB192以及含有OsPT6的酵母转化子生长曲线和吸收磷素能力的比较,发现OsPT6表达后可以增强突变体对磷的吸收,但是作用略低于WT。采用同位素标记的方法对OsPT6吸收磷的速率作进一步分析表明,磷转运蛋白OsPT6吸收磷素的Km值为96μM,属于高亲和磷转运蛋白。 3、通过转化OsPT6的酵母对不同pH环境响应结果表明:OsPT6是一个依赖于酵母细胞膜内外质子梯度的磷转运蛋白,其吸收磷素的最佳pH为6.0;OsPT6是通过Pi/H~+的共转运实现对磷素的吸收并依赖于细胞膜上的H~+-ATPase产生质子梯度及提供能量。 4、通过融合蛋白表达技术将OsPT2和OsPT6两个基因在哺乳动物HEK293细胞中的表达分析表明,该基因能够编码蛋白质并于细胞膜上表达,与其功能特点相一致。 综上所述,OsPT6在酵母系统的表达说明该基因是一个与质子共运输的的高亲和磷转运蛋白,OsPT2不能在酵母中检测到表达。而水稻OsPT2和OsPT6都可以在HEK293细胞中表达,是定位在细胞膜上的运输蛋白。


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