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八棱海棠actin基因的克隆与GO基因转化拟南芥研究

徐锦涛  
【摘要】: 本文通过RACE技术克隆了八棱海棠的肌动蛋白基因,5'-RACE获得长度1121bp的片段、3'-RACE获得883bp的片段,再通过设计引物扩增得到八棱海棠中肌动蛋白基因的cDNA的全长序列。该序列全长1134bp,推测其编码377个氨基酸,等电点为5.16。并分析了其作为内标的可能性。通过实验验证其可以作为内标用于八棱海棠其它基因的表达情况研究。 过氧化氢(H_2O_2)在植物受到病原微生物侵染后引发的一系列防御反应中起着非常重要的作用,因此通过外源基因导入提高植物体内过氧化氢的含量,可以增强植物的广谱抗病性。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GO)可以催化β-D-葡萄糖氧化生成过氧化氢和葡萄糖酸,此酶已在数种细菌和真菌中检测到,但在植物和动物中仍未发现。本研究通过构建含GO基因的植物双元载体,通过农杆菌介导法,用CaMV35S启动子控制GO基因表达的植物双元载体转化拟南芥,对GO基因进行功能鉴定。通过农杆菌蘸花法共获得12株拟南芥阳性植株,GUS染色和PCR鉴定结果初步显示,外源的GO基因已经整合到转基因的拟南芥基因组中。RT-PCR分析结果显示,GO基因在转基因拟南芥中已经表达。通过对转基因和对照的拟南芥的过氧化氢的含量测定,观测到转基因的拟南芥的过氧化氢含量要高于对照的拟南芥。通过对转基因的植株和非转基因植株的DAB染色,结果表明转基因拟南芥中积累的深棕色物质要比对照的拟南芥多。通过对转基因和对照拟南芥类黄酮含量测定,分析结果显示转基因植株的类黄酮含量比对照高。此外,转基因植株的抗病性也比对照显著提高。 然后准备构建植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将GO基因转入八棱海棠,运用MrACT作为内标,来研究相关基因的表达情况。


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