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马尾藻多糖的分离纯化、生物活性及结构分析

叶红  
【摘要】: 马尾藻(Sargassum pallidum)属褐藻门马尾藻科植物,盛产于我国黄海、渤海沿岸各地,资源十分丰富,由于不能直接食用,以致目前马尾藻的加工利用范围比较窄,只有小部分被用作饲料、藻胶和医药工业的原料,大部分尚未得到全面的开发利用。褐藻糖胶(褐藻多糖)是褐藻中的一种杂多糖,具有多样的生理功能,是褐藻中重要的生物活性物质。目前国内外对马尾藻中的多糖(S.pallidum Polysaccharides,SPP)研究很少,且不够深入。鉴于此,本文对采自山东荣成的马尾藻中多糖的体外抗肿瘤活性与体外抗氧化活性,以及多糖的结构进行了研究,以期了解它们的生理活性与结构。 本论文共有四个部分,分别对马尾藻多糖的提取、分离纯化和理化性质、体外抗肿瘤活性与抗氧化活性、结构鉴定进行了研究。主要结果如下: 1马尾藻多糖的提取 利用超临界二氧化碳(SC-CO_2)脱除马尾藻粉中的脂类物质,研究了超临界CO_2萃取压力、萃取温度、萃取时间对马尾藻脱脂过程的影响。研究结果表明CO_2的流量为20 L/h时,超临界CO_2脱脂的最佳工艺条件为:萃取压力45 MPa,萃取温度55℃,时间6 h,萃取率为8.53‰。 将响应面分析法用于马尾藻多糖的提取工艺,对影响马尾藻多糖提取的主要因素超声波破碎时间、提取温度、提取时间的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨,依据回归分析结果,最佳工艺条件是:超声波破碎时间为469.54 s,提取温度为90.94℃,提取时间为4.96 h,多糖得率的理论值为2.48%。对三氯乙酸(TCA)脱蛋白条件进行了优化,选择TCA终浓度为2%左右,TCA沉淀蛋白的时间为2h或稍长。 在压力0.5 MPa,温度20℃下,对脱蛋白后的提取液进行膜分离,提取液依次用孔径0.1μm的微滤膜、截留分子量为100 KDa、50 KDa、10 KDa和3 KDa的超滤膜进行膜分离。研究结果表明多糖组分主要包含在分子量大于50 KDa的截流液中,由于大于孔径0.1μm的截流溶液中所含多糖量较多,成分较复杂,将其单独收集分析。分子量小于50 KDa的溶液多糖含量较少,将其合并。在以后的实验中将SPP提取液分成三部分SPP-1(>0.1μm)、SPP-2(<0.1μm且>50 KDa)和SPP-3(<50 KDa)。 研究了马尾藻料液浓度对膜分离的影响,在料液比分别为1:20(m/V)、1:30、1:100、1:150,压力为0.5 MPa,温度为20℃时,将脱蛋白后的提取液进行膜分离,结果表明随着料液比的增加,膜分离后的多糖损失越少。综合考虑,在膜分离前将待处理的溶液按1:150稀释。在温度20℃时,压力分别在0.1、0.3、0.5 MPa下进行膜分离,结果表明操作压力对多糖损失并无显著影响,在膜分离设备允许压力范围内,0.1-0.5 MPa都是适合的。 2马尾藻多糖的纯化 多糖组分SPP-1、SPP-2和SPP-3占粗多糖百分比分别为72.15%、16.69%和11.16%,其中的多糖含量依次为58.13%、18.98%和16.38%,蛋白含量依次为1.09%、1.75%和1.73%,硫酸基含量依次为15.68%、15.26%和22.62%,糖醛酸含量依次为14.22%、14.30%和5.20%。 利用DEAE Cellulose-52层析柱分别对SPP-1、SPP-2和SPP-3三个多糖组分进行分离纯化,其中由SPP-1得到两个主要的组分SPP-1-1和SPP-1-2,得率分别为32.53%和8.67%;由SPP-2得到SPP-2-1、SPP-2-2和SPP-2-3三个组分,得率分别为10.53%、9.20%和36.33%;由SPP-3得到SPP-3-1和SPP-3-2两个组分,得率分别19.52%和57.27%。在纯化过程中多糖有部分损失,同时粗多糖中的蛋白基本被除去。利用Sephadex G-100层析柱分别对SPP-1-1、SPP-1-2、SPP-2-1、SPP-2-2、SPP-2-3、SPP-3-1和SPP-3-2七个组分进行分离纯化,以用于进一步的结构分析。 3马尾藻多糖的体外抗肿瘤活性与抗氧化活性 以MTT比色法探讨了经DEAE Cellulose-52纯化得到的七个多糖组分对人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2和人胃癌细胞株MGC-803生长的体外抑制作用。组分SPP-3-1和SPP-3-2对人肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞株A549和人胃癌细胞株MGC-803的生长具有明显的体外抑制作用,且抑制能力具有剂量依赖性。组分SPP-2-3只对肝癌HepG2细胞表现出强抑制率,并呈剂量依赖性。组分SPP-3-1和SPP-3-2具有较高的体外抗肿瘤活性可能与它们的低分子量(<50 KDa)及高硫酸基含量(22.62%)有关。 在浓度为2 mg/mL时,粗多糖组分SPP-1、SPP-2和SPP-3对DPPH自由基的清除率分别为23.84%、13.23%和12.83%;总抗氧化能力分别为0.087、0.083和0.088(μmolFeSO_4/mg);还原力(以700 nm处的吸光度A_(700)表示)分别为0.785、0.446和0.541;对·OH的清除率分别为68.39%、13.22%和27.59%。 研究了乙醇浸提温度对马尾藻中总多酚含量的影响,在30℃马尾藻中的多酚类物质不能完全浸提出来;在70℃因浸出时间短不易控制,所以选择50℃作为乙醇浸提温度。马尾藻经50℃、70%乙醇浸提后,依次用不同有机溶剂萃取后得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取剩余物,其占总萃取物百分比依次为15.76%、5.28%、78.96%,采用Folin-Ciocalteu比色法测定其中的总多酚含量,以绿原酸(CHA)作为标准物质,依次为3.20 mgCHA/g干重、12.12 mgCHA/g干重和52.08 mgCHA/g干重,总萃取物得率为8.07%。 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物在浓度为2 mg/mL时对DPPH自由基清除率分别为30.59%和29.36%。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的总抗氧化能力较高,分别为0.520和0.345(μmolFeSO_4/mg)。乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取剩余物的还原力较高,由高到低为萃取剩余物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取剩余物在浓度为2 mg/mL时对金属离子的螯合率分别为48.25%、51.34%和17.21%。 4马尾藻活性多糖的结构分析 利用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定多糖组分SPP-2-3、SPP-3-1、SPP-3-2的分子量和检测其纯度,其平均分子量(M_w)依次为132.999 KDa、5.874 KDa、7.249KDa。气相色谱法分析多糖的单糖组成,SPP-2-3单糖组成及摩尔比为鼠李糖:木糖:岩藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.15:2.74:0.64:1.00:0.49:1.11,SPP-3-1单糖组成及摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:11.18:0.96,SPP-3-2单糖组成及摩尔比为鼠李糖:木糖:岩藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.17:2.53:0.61:1.00:0.46:0.92。通过红外吸收光谱(IR)分析得知SPP-2-3和SPP-3-2中存在(?)糖苷键。 高碘酸氧化、Smith降解以及甲基化分析结果显示SPP-2-3中的甘露糖的连接方式以(1→3)糖苷键为主,葡萄糖和半乳糖除了存在(1→3)键型外,还存在(1→6)键连接方式;木糖的连接方式以(1→2)键为主;岩藻糖除了存在(1→3)键型外,还存在(1→4)键型。SPP-3-2中的甘露糖和半乳糖的连接方式以(1→3)键为主;葡萄糖是以(1→6)或者(1→2)键型连接;木糖和岩藻糖以(1→2)或(1→4)键型连接为主。


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