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中国栽培灵芝三萜成分的高效液相指纹图谱研究

史先敏  
【摘要】: 灵芝在中国被用来统称Ganoderma这一属的药用真菌,它自古以来就被认为是一种名贵药材,可以延年益寿。今天灵芝仍被广泛作为一种保健品和药品,灵芝的药理和营养研究证明它的确含有一定的活性成分可以对一些疾病起到预防和治疗的作用,如高血压、糖尿病、肝炎、癌症和艾滋病。 随着灵芝人工栽培的成功,灵芝子实体、菌丝体以及相关产品被广泛用作功能性食品和药品。但由于灵芝的菌种鉴定和分类工作远远不够,造成灵芝的生产用菌种比较混乱,种属归属的不确定性往往会造成研究结果的错误或不同解释,这是灵芝研究和质量控制存在的一个严重问题。色谱指纹图谱技术为中草药鉴定和质量控制提供了一个新的合理的解决途径,近几年已经应用这种方法对很多中草药进行了鉴定。虽然已经有应用HPLC方法对灵芝进行分类的研究.,但还没有应用指纹图谱技术对中国栽培灵芝菌种进行资源调查性质的研究。灵芝的生产研究目前还主要是产量、性状方面的基础研究,我们把HPLC技术引入到灵芝的生产研究中,从灵芝子实体三萜成分、菌丝体三萜成分的角度进行了比较,对指导灵芝的生产具有新的意义。指纹图谱研究的高级阶段是把化学指纹图谱和药效相结合,这也是中草药指纹图谱亟待解决的问题。本文应用灰色关联度分析的方法初步把灵芝三萜指纹图谱和三萜药效结合起来。 本文共分六个部分,分别从HPLC指纹图谱在灵芝分类上的应用,相似度分析软件的建立,模式分类研究,菌丝体三萜提取物HPLC指纹图谱和药理指纹图谱的建立,HPLC指纹图谱技术在灵芝实际生产中的应用和灰色关联度分析六个方面进行了研究。主要结果如下: 1灵芝三萜指纹图谱的构建 建立了灵芝子实体三萜的提取条件:1 g样品中加95%乙醇至50 mL静置过夜,过滤,上清蒸干,加甲醇定容至1.5 mL,10000xg离心5 min,过滤,取上清液1 mL上反相色谱柱。HPLC色谱条件:反相色谱柱(YMC-Pack ODS-AQ,5μm,250 mmx4.6mm i.d.YMC,Japan);流动相由A、B两部分组成,A为含1%冰醋酸的超纯水,B为色谱级甲醇,A:B=52:48,流速:1.0 mL/min,柱温:30℃。检测波长250 nm,检测时间90 min。获得了所有供试菌株的HPLC色谱图,对所有菌株进行了分类研究,105个菌株被分成20类,建立了分类组A、B的标准HPLC指纹图谱,为以后的质量控制工作建立了标准。 2相似度分析软件的建立 与德门软件公司合作建立了Dminer指纹图谱相似度分析软件。软件采用图谱序列分段来对图谱数据进行处理,采用多个图谱的相似性查找进行相似度计算。· 3模式分类在灵芝指纹图谱分析中的应用 应用SPSS 13.0统计软件对105个菌株进行了聚类分析,所有样品被分成20组。选取15个样品进行判别分析,建立了两个判别函数:典则判别函数和Fisher's判别函数。 典则判别函数: Y_1=-23.448+24.895X_1+14.394X_6-20.210X_8-8.528X_(20)+5.995X_(24)+6.902X_(32)Y_2=-9.938-16.254X_1+23.608X_6+8.213X_8-10.460X_(20)+2.146X_(24)+2.686X_(32)Y_3=-6.562-2.331X_1+5.499X_6+1.582X_8+3.101X_(20)-1.823X_(24)+0.533X_(32)Y_4=-0.169-1.768X_1+2.676X_6-2.539X_8+1.062X_(20)-0.403X_(24)+1.141X_(32) 判别标准为:Y_10且Y_20且Y_30且Y_40:判为第一类Y_10且Y_20且Y_30且Y_40:判为第二类Y_10且Y_20且Y_30且Y_4=0:判为第三类Y_10且Y_20且Y_30且Y_40:判为第四类Y_10且Y_20且Y_30且Y_40:判为第五类 Fisher's判别函数:·'Y_1=-65.602-192.393X_1+197.155X_6+114.916X_8-37.872X_(20)-10.227X_(24)+11.469X_(32)Y_2=-3088.592+1185.282X_1+1854.772X_6-1135.129X_8-940.602X_(20)+485.312X_(24)+581.760X_(32)Y_3=-12443.598+4237.206X_1+1740.703X_6.3327.746X_8-1062.902X_(20)+870.498X_(24)+1017.906X_(32)Y_4=-4.167+37.605X_1+50.804X_6-35.973X_8-25.317X_(20)+13.763X_(24)+16.992X_(32)Y_5=-1.609 在实际应用中将受检样品的相应指标分别代入5个判别函数中计算,可求出5个判别函数值,受检样品归于函数值最大的类。 4菌丝体三萜提取物HpLC指纹图谱和药理指纹图谱的建立 本研究中摇瓶培养和静置培养胞外液三萜提取物对肿瘤细胞均表现较低抑制活性,抑制率小于45%,反映在HPLC图谱上出峰主要集中在40分钟之前,在60-75分钟内没有出峰。静置培养阶段菌丝体内三萜大量合成,这些三萜可以提高提取物对肿瘤细胞L1210的抑制率,主要表现在60-75分钟之间出峰,且随培养时间延长三萜种类和含量均增加,抑制率也随培养时间延长而升高。G.lucidum 156提取物对肿瘤细胞的抑制率在时间点J148升高到90%以上,然后保持这个水平。G.lucidum 16提取物对肿瘤细胞的抑制率在时间点J268升高到90%以上,然后保持这个水平。 G.Zucidum 156子实体与培养70天的茵丝体三萜提取物HPLC图谱相似度为: 0.90113,子实体三萜提取物对肿瘤细胞的抑制率为71%,培养70天的菌丝体对肿瘤细胞抑制率为90%,说明在合适的培养条件下能获得对肿瘤抑制率比子实体对肿瘤抑制率更高的菌丝体发酵产物。G.lucidum 16结论相同。5 HPLC指纹图谱技术在灵芝生产中的应用研究 通过对不同覆土时间的样品,不同生长期的样品,不同栽培方式的样品的三萜图谱比较我们发现生产中这些参数的不同对三萜产量的影响比较大,本文数据表明不同的培养方法和生长期其三萜含量大部分差异在20%以上,高的达到70%以上,生产中袋料栽培栽培的样品三萜含量高于椴木栽培的样品,开片期的样品三萜含量高于成熟期的样品,覆土1个月的样品三萜含量高于覆土1.5个月的样品。相似度数据表明同一菌种的菌株在不同覆土时间,不同生长期,不同栽培方式栽培的子实体其HPLC图谱相似度很高,都在0.98以上。 利用HPLC指纹图谱技术研究从同一灵芝子实体不同部位组织分离获得的菌株三萜化合物的差异。用常规组织分离方法获得不同菌株,在A、B、C、D四种培养基上进行出菇试验,运用HPLC指纹图谱技术获得各子实体三萜提取物HPLC指纹图谱,计算图谱间的相似度,分析三萜指纹的差异。结果表明,从子实体不同部位分离获得的四个菌株在同一培养基相同条件下培养获得的灵芝子实体的三萜指纹图谱相似度均大于0.99;同一部位分离获得的菌株在不同培养基相同培养条件下获得的子实体,其粗三萜HPLC图谱相似度均大于0.96;不同的组织分离部位和不同的培养基对灵芝菌株三萜指纹图谱的影响均不显著。18号菌株在C培养基上培养获得的子实体三萜含量最高,上层菌肉为最优组织分离部位,C培养基为最优培养基。灵芝的.三萜组成不受生长环境的影响,而生长环境会对其三萜化合物含量产生一定的影响。 6灵芝三萜指纹图谱特征与药效关系的研究. 应用灰色关联度分析方法得出了灵芝三萜的指纹特征与其肿瘤抑制率之间的关联系数和关联度。结果表明:t_R31.397、t_R25.058、t_R25.980、t_R26.681、t_R27.772、t_R29.431、t_R32.225、t_R15.739、t_R22.523、t_R16.829、t_R20.131 min等峰所代表的化学成分与样品的肿瘤抑制率具有高度关联(关联度3.5)。依据关联度的大小,确定各成分对肿瘤抑制率贡献的大小从小到大依次为:t_R11.329,t_R37.709,t_R38.680,t_R12.918,t_R10.699,t_R35.692,t_R14.689,t_R34.573,t_R41.242,t_R13.375,t_R44.671,t_R28.590,t_R14.012,t_R12.279,t_R31.397;t_R25.058,t_R25.980,t_R27.772,t_R26.681,t_R29.431,t_R32.225,t_R15.739,t_R22.523,t_R16.829,t_R20.131。


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