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稻瘟病菌Mgvam7基因的克隆与功能分析

豆献英  
【摘要】: 稻瘟病是世界上最严重的粮食作物病害之一,由于稻瘟病菌研究的重要经济和社会意义及稻瘟病菌容易培养、遗传转化体系成熟等特点,稻瘟病菌已经成为植物病原真菌研究的模式系统。膜泡运输对于蛋白质的运输和分泌至关重要,其中SNARE蛋白是膜泡运输过程中十分保守的一类蛋白。稻瘟病菌在侵染植物过程中分泌大量的外泌蛋白,而迄今关于膜泡运输系统在植物病原真菌的致病性及其生长发育、细胞分化等方面的作用鲜有报道。为了分析膜泡运输相关组分在稻瘟病菌中的功能,本研究对稻瘟病菌膜泡运输SNARE蛋白基因Mgvam7的功能进行了研究。 首先根据同源序列比对,在稻瘟病菌基因组数据库搜索到一个与酵母vam7基因同源的基因,命名为Mgvam7,序列分析表明该基因编码的蛋白含有375个氨基酸,其氨基酸序列与酵母的SNARE蛋白vamp7的同源性仅为24%,该蛋白包含一个PX结构域和一个SNARE结构域;该基因可以互补酵母vam7基因突变体在含有CalcoflourWhite(CFW)的培养基平板上的生长缺陷,同时FM4-64染色显示该基因能够互补酵母突变体液泡形态上的缺陷,表明该基因编码一个具有SNARE蛋白功能的VAM7蛋白。进一步将报告基因eGFP构建在Mgvam7基因的启动子下游来分析该基因表达的组织特异性,结果发现该基因在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞阶段均有表达。 采用原生质体转化和同源重组技术获得了稻瘟病菌的Mgvam7敲除突变体,对其多种生物学表型进行了分析,结果显示突变体对金属离子、营养、渗透压等液泡功能相关的胁迫耐受性减弱。已证明在稻瘟病菌中,脂肪粒主要主要存在于液泡中,可以通过采用Nile red染色法观察脂肪粒来分析液泡形态的变化。该染色法发现,与野生型菌株相比,突变体脂肪粒增多,且多呈碎球状,表明突变体的液泡发生片段化。细胞壁和细胞膜胁迫因子处理发现突变体而对SDS更加敏感而对CFW的耐受增加,同时对菌丝进行CFW染色显示突变体细胞壁几丁质分布发生变化。顶体结构是真菌菌丝顶端重要的细胞器,通常与真菌极性生长、细胞壁合成相关。FM4-64染色观察到突变体菌丝顶端不能形成正常的顶体结构。同时采用FM4-64跟踪试验观察到突变体不能进行正常的胞吞作用,而BFA处理可以部分恢复突变体的胞吞作用,表明BFA作用于Mgvam7的下游调控胞吞作用。已证明活性氧对真菌发育和极性生长有重要调节作用,利用荧光染料对菌丝顶端活性氧染色发现突变体内活性氧积累显著减少。进一步产孢分析发现突变体存在严重的产孢缺陷,采用菌丝片段离体接种发现突变体均不能侵染大麦和水稻。 综上研究表明Mgvam7既可以维持液泡形态和功能,同时对细胞壁完整性、胞吞作用、活性氧积累、分生孢子的产生及其致病性均有调控作用,提示MgVAM7在稻瘟病菌的生长、发育、致病性过程中是一个功能多样化的SNARE蛋白。


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