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油菜及小繁缕中与核盘菌毒性因子PG互作蛋白编码基因的筛选及其特征研究

杨恩东  
【摘要】:油菜(Brassica napus)是重要的经济作物和主要的油料作物,在国民经济和农业生产中具有重要作用,而由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病则是我国油菜生产上的重要病害,目前还没有高抗或免疫的抗病品种。研究核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)与油菜等宿主互作的分子机制,寻找一些致病或抗病相关基因,无疑对菌核病的防治有着重要意义。本研究利用酵母双杂交技术(Y2H),建立了核盘菌诱导的油菜品系RS-1(对核盘菌有部分抗性)及其田间杂草小繁缕(Stellaria apetala Ucria,经接种鉴定对核盘菌免疫)的cDNA文库,以核盘菌毒性因子PG为诱饵蛋白在上述2个文库中筛选到一些互作蛋白,并结合半定量PCR,实时PCR,瞬时表达及亚细胞定位等技术对一些基因进行了初步分析。研究的主要结果如下: 一、根据加拿大学者Li等(Li et al.,2004)在NCBI中提交的PG基因序列ORF两端保守区设计引物,通过RT-PCR的方法克隆到了菌核病毒性因子PG基因sspg1d(NCBI编号为AF501307),并将其克隆到酵母载体pGBKT7上,构建成诱饵载体PG/pGBKT7,为进一步的双杂交筛选奠定了基础; 二、分别以油菜和油菜田间杂草小繁缕为材料,构建成了核盘菌诱导的cDNA文库,并且利用构建好的诱饵进行筛选,在油菜中筛选到1个与PG互作的含C2结构域蛋白因子(命名为IPG-1),C2结构域可与钙离子结合,暗示PG信号转导与钙离子有关。在小繁缕cDNA文库中筛选到1个膜蛋白(命名为XFL-PG-1)及其它6个与抗逆及细胞凋亡等有关的基因,为菌核病的分子防治提供了依据: 三、利用半定量RT-PCR,实时PCR技术分析了IPG-1在mRNA水平上的表达差异,发现IPG-1受核盘菌诱导后表达量迅速增加,而且受诱导后在叶片中表达量最多,茎中次之,花中最少;酵母双杂交实验证明IPG-1中与PG互作密切相关的部位位于该基因编码蛋白的C端;瞬时表达研究表明IPG-1编码产物分布于细胞质和膜上,而XFL-PG-1则分布于细胞膜上; 四、分别构建了IPG-1的过表达载体、RNA干扰载体,为研究该基因的功能奠定了基础;并且构建了PG和IPG-1的原核表达载体PG-pGEX4T,IPG-1-pET30a,以便进一步研究二者在体外的互作关系;通过RACE和RT-PCR克隆了IPG-1在拟南芥中的同源基因及核盘菌中致病过程中的一个转录因子PAC1基因的片段,构建了它们的干扰载体AIPG-i-pART27,PAC1-i-pART27和PG-i-pART27,用于转基因研究。


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