花烛玻璃化超低温保存及相关生理生化和组织学特征

【摘要】： 花烛(Anthurium andraeanum Lind.)又名红掌,安祖花,为天南星科(Araceae)花烛属(Anthurium)多年生常绿草本植物。因其独特的花型、艳丽的花色、周年开花而成为备受人们喜爱的花卉,具有较高的观赏价值和经济价值。目前,花烛品种越来越多,与之配套的种质资源保存技术相对薄弱,传统的花烛种质资源保存需要大量的人力、物力及土地。因此适宜而且有效的花烛种质资源保存方法对于花烛生产及新品种的选育越来越重要。 本试验在现有花烛离体培养技术的基础上,着重对花烛胚性悬浮细胞系玻璃化超低温保存条件进行了研究,同时探讨了该方法在其它类型材料(花烛茎尖,花烛普通型愈伤组织)上的适用性,初步建立了适宜花烛的玻璃化超低温保存方法,为花烛种质资源的长期保存提供了参考。试验主要研究结果如下： 1.以花烛品种'Amigo'为试验材料,研究了花烛胚性悬浮细胞玻璃化超低温保存条件。结果表明：山梨醇浓度和预培养时间、细胞生理状态、装载液类型及时间、玻璃化溶液处理时间、化冻温度对花烛胚性悬浮细胞存活率均有较大影响。花烛胚性悬浮细胞玻璃化超低温保存最佳条件为：继代培养3～5 d、直径为1～2mm的花烛胚性悬浮细胞在含0.5 mo1／L山梨醇的1／2 MS培养基中悬浮培养2d,4℃低温处理24h,经25%PVS2预处理15 min,100%PVS2 0℃脱水10 min,液氮冻存后40℃水浴化冻3 min,含1.2 mol／L蔗糖的1／2 MS培养基洗涤3次,每次10 min,恢复培养5 d后TTC法测定存活率可达32.1%。将此方法用于花烛Amigo’的茎尖和非胚性愈伤组织,存活率大幅度下降,茎尖无法存活。对花烛胚性悬浮细胞玻璃化超低温保存进行优化,采用浓度为3%的海藻酸钠和0.1mol／L的CaCl2将胚性悬浮细胞包埋成4mm左右大小的包埋丸,进行包埋玻璃化超低温保存,保存效果较胚型细胞直接进行玻璃化保存效果差。 2.以花烛品种'Amigo'胚性细胞为材料,研究了玻璃化超低温保存过程中预培养处理对其生理生化的影响,对山梨醇诱导花烛胚性悬浮细胞抗冻性的生理机制进行了初步分析。结果表明：花烛胚性悬浮细胞经山梨醇预培养处理后,随着山梨醇浓度的升高,含水量持续下降,可溶性糖含量呈上升趋势,可溶性蛋白含量先上升后下降,抗氧活酶(SOD、CAT、POD)活性大幅度提高。且随山梨醇预培养时间的增长,含水量下降,可溶性糖、可溶性蛋白含量显著高于对照,均呈先上升后下降的趋势,抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性也逐渐提高。分析认为预培养是影响玻璃化超低温保存存活率的关键因素,提高了材料抵抗低温的能力. 3.以花烛胚性细胞玻璃化超低温各处理阶段的材料为研究对象,利用石蜡切片技术,对玻璃化超低温保存各处理后的胚性细胞进行组织学上的观察。结果表明：材料经玻璃化超低温各程序处理后,材料组织结构与对照相比发生了变化.玻璃化溶液脱水、冷冻与化冻过程对花烛胚性细胞造成严重的伤害,尤其是冷冻与化冻环节。而预培养过程可以有效降低细胞受损害程度,此外,玻璃化溶液处理之前的预处理可以降低玻璃化溶液直接处理带来的损伤.