收藏本站
收藏 | 论文排版

水稻条斑病菌突变体库构建和致病性功能基因分离鉴别

袁亮  
【摘要】:水稻细菌性条斑病,是由水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xooc)引起,近年来已日渐成为水稻上的重要病害。构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一。为了从全基因组范围内发掘致病性相关基因,本研究构建了一个Tn5转座子介导的水稻条斑病菌插入突变体库。该突变体库包含25 000个突变子,5倍于RS105菌株的基因数(约4600个ORF)。经检测,该突变体库随机性好、稳定性强、饱和度高,是一个质量良好的突变体库。 经水稻上致病性检测和烟草上HR测定,共得到253个在水稻致病性减弱但在烟草上有HR的突变体、29个在水稻上毒性减弱且在烟草丧失HR的突变体、20个在水稻上丧失致病性且在烟草丧失HR的突变体和7个在水稻上丧失致病性但在烟草上有HR的突变体。另外,还筛选得到21黄色素缺失突变体、12个胞外多糖减少突变体、11个生长能力增强突变体和12个蛋白酶缺失突变体。以上这些突变体的获得,为分析水稻条斑病菌致病性相关基因提供了表型基础。 为了快速准确地确定Tn5的插入位点和相应的功能基因,本研究采用TAIL-PCR和Tn5转座子质粒拯救两种技术对筛选得到的突变体进行鉴别。结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离。 在筛选水稻条斑病菌突变体库过程中,得到5个胞外蛋白水解酶活性减弱的突变体和7个胞外蛋白水解酶丧失突变体。通过TAIL-PCR和Tn5质粒拯救法获得了Tn5旁侧序列。经在水稻条斑病菌BLS256基因组序列中同源性搜索发现,12个突变体分别为Tn5插入到Ⅱ型分泌系统结构蛋白、cAMP调节蛋白(cAMP regulatory protein)、膜镶嵌蛋白酶亚基(integral membrane protease subunit).S-蛋硫氨酸脱酸酶酶原(S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme)和胞外蛋白水解酶(extracellular protease)基因中,导致蛋白水解酶活性部分或完全丧失。RT-PCR结果显示,除ΔecpA突变体外,其余的11个突变体在与水稻互作后均能检测到ecpA的表达。用ecpA进行功能互补,能恢复ΔecpA突变体胞外蛋白水解酶活性、在水稻上的毒性和在水稻中的繁殖能力。原核表达纯化得到的蛋白酶产物,能在平板上检测到蛋白酶活性。提取的EcpA蛋白与ΔecpA突变体混合接种到水稻上,也能恢复其在水稻上的毒性。这些结果说明,胞外蛋白水解酶基因ecpA编码合成条斑病菌蛋白酶,是水稻条斑病菌毒性所必需的。


知网文化
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978