黄瓜花药培养及橙色果肉QTL分析和类胡萝卜素合成酶基因定位研究

【摘要】： 黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=2x=14)是世界十大重要蔬菜作物,在世界各地广泛栽植。由于遗传背景狭窄,传统育种效率低,单倍体育种和分子辅助育种(Marker-assisted selection,MAS)越来越受到重视。 1黄瓜花药培养研究 花药培养是获得单倍体(Haploid)和双单倍体(Double haploid,DH)的有效途径,但有关黄瓜花药培养的研究报道目前世界仅见三篇,最近报道的花药培养诱导频率为1.6胚／花药和52单倍体/60花药,花培效率仍需提高。本研究针对花药培养过程中4℃低温预处理、33℃热激预培养、各培养阶段培养基成分和基因型等关键因素,设计6个独立试验,进行研究,结果如下： 1)建立黄瓜花药培养体系 确立黄瓜花药培养各阶段培养基成分：胚性愈伤诱导培养基：MS+1.0 mg/l6-BA+0.5 mg/l2,4-D+1.0 mg/lKT+3%蔗糖+0.8%琼脂；胚诱导培养基：MS+0.1 mg/lNAA+3.0 mg/l6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂；胚萌发培养基：MS+0.5 mg/l 6-BA+6%蔗糖+1.2%琼脂。 明确影响黄瓜花药培养的两个关键因素：一是预处理和预培养温度的选择有赖于试材的生态型；二是胚诱导培养基中6-BA/NAA配合使用能够成功诱导胚性愈伤分化成胚。 2)获得黄瓜花药培养再生DH植株 基于本试验建立的花药培养体系,对31个不同基因型供试黄瓜进行花药培养,16个材料产生胚性愈伤组织,其中3个基因型(宁佳1号、5117和4560)获得再生植株。通过细胞学染色体计数、形态学统计分析和分子标记AFLP技术,确定120个宁佳1号再生植株中42个为双单倍体,花药培养比率为3胚／花药和42DH/45花药。 2黄瓜橙色果肉QTL分析和类胡萝卜素合成酶基因定位研究 类胡萝卜素在人类膳食营养中扮演着极为重要的角色。西双版纳黄瓜(C.sativus L.var.xishuangbannanesis Qi et Yuan,2n=2x=14)成熟果果肉橙色,是培育富含类胡萝卜素黄瓜品种的优异种质。本研究针对黄瓜果肉颜色和主要类胡萝卜素含量进行数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)分析,为分子辅助育种(MAS)提供可靠的QTL标记；同时对黄瓜类胡萝卜素合成酶基因进行定位,为在分子水平上明确黄瓜类胡萝卜素合成途径提供目的基因。主要研究内容结果如下： 1)遗传图谱的构建 以白色果肉黄瓜与橙色果肉黄瓜构建两个F2作图群体(EC1×SWCC9和Gy7×USDA#14),群体大小分别为79和143个单株。利用RAPD、SCAR、SSR、EST、SNP、AFLP和SSAP分子标记绘制遗传图谱。最终获得图谱1包含74个多态性位点,全长899.0cM,16个连锁群,平均间距12.0cM；图谱2包含23个位点,分作7个连锁群,全长230.9cM,平均间距9.6cM。 通过比较两张图谱的分子标记信息,发现图谱1的连锁群(Linkage group,LG) 6和图谱2的LG3上存在一个共线性区域,包括3个显性标记(RAPD_AG13_1200、RAPD_P11_750和SNP_N8SNPG2H3_569)和1个共显性标记(SNP_AB14SNPG1H1_470/519)。 2)果肉颜色QTL的分析 基于两个F2群体进行黄瓜果肉颜色QTL分析,在群体1上检测到4个控制中果皮颜色(Mesocarp color, MC)的QTL(mc6.1、mc6.2、mc9.1和mc15.1),和5个控制内果皮颜色(Endocarp color, EC)的QTL(ec6.1、ec6.2、ec6.3、ec9.1和ec16.1)。在群体2上检测到2个控制中果皮颜色的QTL(mc2.1、mc3.1)和3个控制内果皮颜色的QTL(ec2.1、ec3.1、ec5.1). 其中位于图谱1的2个果肉颜色QTL (mc6.1和ec6.1)与图谱2的2个果肉颜色QTL(mc3.1和ec3.1)位于两个图谱的共线性区域,说明它们是在西双版纳黄瓜遗传背景下稳定出现的控制果肉颜色的QTL。 3)果肉类胡萝卜素含量的QTL分析 对群体2单株的白色果肉和橙色果肉进行高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)分析,明确β-胡萝卜素和叶黄素是橙色果肉的主要类胡萝卜素成分。 利用群体2,对这两种橙色果肉中主要类胡萝卜素含量进行QTL分析,结果在图谱2上检测到1个控制中果皮β-胡萝卜素含量的QTL位点(mdb2.1),2个控制内果皮β-胡萝卜素含量的QTL位点(edb2.1和edb3.1),2个控制中果皮叶黄素含量的QTL位点(mdx3.1和mdx3.2),和1个控制内果皮叶黄素含量的QTL位点(edx3.1)。 其中控制内果皮β-胡萝卜素含量的QTL位点(edb3.1)和控制中果皮叶黄素含量的QTL位点(mdx3.1)与果肉颜色QTL(mc3.1和ec3.1)位于相同的区间内。 4)黄瓜类胡萝卜素合成酶基因定位 通过同源引物设计,最终将黄瓜类胡萝卜素合成酶基因9-顺式类胡萝卜素双加氧酶基因(9-cis-Epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)以单核苷酸多态性(Single nucleotide Polymorphism,SNP)标记形式,定位于两张图谱共线性区域的不同位置。NCED的引入,没有改变图谱原有序列。 5)其他农艺性状的QTL定位 针对群体1的子叶长(Cotyledon length,CL).下胚轴长(Hypocotyl length, HL)、第一分枝节数(Node of first branch, NFB)、主茎直径(Diameter of main stem, DM)、叶长(Leaf length, LL)和叶宽(Leaf width, LW)等农艺性状,和群体2的果实长(Fruit length, FL,)、果实纵径(Fruit width, FW)和果肉糖含量(Sugar content,S)等性状进行QTL分析,结果发现糖含量(s3.1)与果肉颜色(mc3.1和ec3.1)和类胡萝卜素含量(edb3.1和mdx3.1)位于相同的区间内。