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不同倍性黄瓜(Cucumis sativus L.)材料的创制及遗传分析

刁卫平  
【摘要】: 黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=14)隶属于葫芦科,黄瓜属,是一种重要的世界性蔬菜作物。通过单倍体诱导技术可以快速获得纯系(单倍体和双单倍体),进而加快黄瓜的育种进程。同时,通过选育不同倍性(整倍体和非整倍体)的新种质资源材料,不仅可以增加黄瓜的商业价值,而且对促进它的分子细胞遗传学研究也具有重要价值。为此,本论文利用不同基因型的黄瓜品种为试材进行未授粉子房培养,以期获得单倍体和双单倍体材料,建立其诱导单倍体的技术体系;利用未授粉子房培养获得的同源四倍体材料进行杂交、回交,筛选出了一系列同源三倍体、初级三体及早世代稳定遗传的二倍体黄瓜材料;此外,采用细胞遗传学和分子标记技术对这些获得的新种质材料进行了鉴定与评价,以期为黄瓜的倍性育种打下基础。具体结果如下: 1.黄瓜未授粉子房培养诱导单倍体/双单倍体技术体系的建立 研究了热激处理时间、TDZ和AgNO3浓度对黄瓜未授粉子房培养过程中胚状体发生率的影响。结果表明,子房培养开始阶段进行35℃热激处理的胚发生率显著高于对照(0 d),其中处理2 d的效果较好;TDZ对提高胚状体发生率具有显著效果,添加0.04 mg·L-1TDZ的诱导培养基培养的最大胚状体发生率可达72.7%;在诱导培养基中添加AgN03可以提高胚状体发生率,同时能缩短胚状体出现的时间并提高胚状体产量。最后,在3种不同基因型黄瓜材料中共获得了40个再生植株,经染色体计数后发现2株为单倍体,5株为同源四倍体,剩下33株为二倍体。利用SSR手段对获得的二倍体植株进行同质性分析后发现,17株为双单倍体。 2.同源四倍体黄瓜的培育及分子细胞遗传学研究 利用SSR手段对未授粉子房培养获得的同源四倍体植株进行同质性分析后,发现它们均为纯合子。利用形态学观察和染色体计数法对同源四倍体单株自交后代的遗传稳定性进行了研究,结果表明自交后代倍性没有发生变异。对同源四倍体植株花粉可染率、花粉萌发率及自交结籽数分别进行观察后发现,所获得的同源四倍体具有较高的育性。 对同源四倍体黄瓜(Tetra-Jinlv)花粉母细胞减数分裂与雄配子体发育观察结果表明,同源四倍体黄瓜花粉母细胞减数分裂过程与二倍体基本相同但有其特殊性。主要表现为:中期Ⅰ染色体的构型复杂,有多价体、四价体、三价体、二价体和单价体;中期Ⅰ和中期Ⅱ有赤道板外染色体;后期Ⅰ和后期Ⅱ出现落后染色体、染色体桥;后’期Ⅱ和末期Ⅱ还出现染色体分离不同步及不均等分裂的现象;四分体时期出现二分体、三分体、含微核的异常四分体及多分体。花粉母细胞减数分裂平均异常频率为37.2%。正常四分体中的小孢子,大多数可以发育成具有三孔、两细胞的可育雄配子,小孢子的发育主要经过以下几个阶段:单核早期、单核晚期、两核期。花粉萌发试验发现同源四倍体的花粉萌发率仅为46.9%。 此外,利用分子细胞学研究手段对两种不同来源途径四倍体(Tetra-5来自未授粉子房培养;Tetra-Jinlv来自秋水仙素处理)以及原始二倍体进行了遗传分析。细胞学研究结果发现,同源四倍体Tetra-5在减数分裂各个阶段染色体异常行为频率明显较Tetra-Jinlv要低,尤其在后期落后染色体数目上。对比两种同源四倍体在中期Ⅰ的染色体构型发现,同源四倍体Tetra-5较Tetra-Jinlv含有较多的四价体、较少的单价体和三价体。同时,采用AFLP技术对这两类同源四倍体及原始二倍体进行基因组DNA多态性分析后发现,从38对引物扩增获得的2214条60-500bp条带中,多态性位点仅有50个,占2.26%。在多态性位点表现中,二、四倍体特异性条带分别为0.50%和0.18%。比较两种不同来源途径同源四倍体扩增条带后发现,同源四倍体Tetra-5较Tetra-Jinlv表现出更多的遗传变异,共扩增出新增条带26条。研究结果表明,不同倍性及不同来源途径黄瓜在分子细胞遗传学水平上存在广泛的遗传变异。体细胞无性系变异引起了同源四倍体在DNA水平上更广泛的变异。 3.同源三倍体黄瓜的培育及其细胞遗传学研究 采用常规杂交法探讨了黄瓜二、四倍体杂交过程中亲本育性、授粉组合及亲本基因型对杂交结实率的影响。结果表明:同源四倍体自交结实率比较低(13.0%-14.5%),可能与其花药内所包含的正常花粉粒比例小及花粉管萌发长度较短有关;二、四倍体杂交组合的结实率很低(0.26%-1.02%),但在两种配组方式之间存在着明显差异,即以同源四倍体黄瓜为父本、二倍体黄瓜为母本的杂交结实率比较高,反之则杂交结实率比较低;在二、四倍体杂交过程中,二、四倍体的基因型对杂交结实率的影响较大,以杂交双亲同属一个基因型的杂交效果较好。 对同源三倍体黄瓜花粉母细胞减数分裂行为及雄配子体发育进行观察后发现,同源三倍体黄瓜花粉母细胞减数分裂过程与二倍体基本相同但有特殊性。主要表现在:中期Ⅰ染色体的构型复杂,有多价体、四价体、三价体、二价体和单价体;中期Ⅰ和中期Ⅱ有赤道板外染色体;后期Ⅰ和后期Ⅱ出现落后染色体和染色体桥;后期Ⅱ和末期Ⅱ还出现染色体分离不同步及不均等分裂的现象;四分体时期出现二分体、三分体、含微核的异常四分体及多份体。正常四分体中的小孢子,有约91.2%的能发育为具有三孔两细胞的可育配子,小孢子的发育主要经过以下几个阶段:单核早期、单核晚期、两核期。花粉育性检测发现,同源三倍体的可染率和萌发率分别为18.8%和13.5%,表明其育性较低。 4.黄瓜初级三体系的培育及其细胞遗传学研究 为促进黄瓜的分子细胞遗传学研究,本研究利用黄瓜同源三倍体与二倍体正反交来培育初级三体。同时,对同源三倍体黄瓜减数分裂后期Ⅰ染色体分离情况进行了观察,以期为二、三倍体杂交培育初级三体提供细胞学证据。研究结果表明:二、三倍体正反交后获得了大量的种子,存活下来的56个子代的染色体数从14到28不等,其中染色体数为15的植株占了较大的比例(51.8%)。本研究首次获得了4种不同类型的黄瓜初级三体材料,并能各自相互区分出来。对同源三倍体花粉母细胞减数分裂染色体行为观察后发现,后期Ⅰ染色体分离符合正态分布规律,其中8/13型染色体分离的比例为6.25%。同源三倍体减数分裂,特别是8配子的形成为二、三倍体正反交后产生2x+1配子及初级三体的获得提供了细胞学证据。 5.不同倍性黄瓜材料遗传差异的AFLP分析 采用AFLP技术对黄瓜品种‘津绿四号’的单倍体、二倍体、三体、三倍体和四倍体进行基因组DNA多态性比较。从51对引物扩增获得2922条60-500bp的条带,检测出多态性位点152个,占5.2%,其中13对引物组合在不同倍性材料扩增条带没有差异。在多态性位点表现中,以三体和四倍体同时扩增出条带为主,占2.293%。与相应二倍体相比,三倍体、初级三体和四倍体都有特异片段的增加。结果表明,不同倍性黄瓜材料之间在DNA水平上存在广泛的遗传变异。 6.二、三倍体杂交获得早世代稳定遗传的F2群体 早世代稳定遗传群体的获得可以加速育种进程。利用由未授粉子房培养获得的同源四倍体(Tetra-1)与双单倍体(DH-Jinlv)杂交得到的同源三倍体(Tri-Jinlv),与双单倍体黄瓜翠玉(DH-Cuiyu)进行正反交,在杂种Fl代中发现有非整倍体和二倍体个体产生,其中一个二倍体的自交后代(F2)在田间农艺性状表现稳定。对这个稳定F2群体进行微卫星验证,结果表明:F1和F2群体30个单株的扩增带型整齐一致,在各个SSR多态位点只出现一条同父或同母带,丢失了来自另一亲本的等位位点,说明该F2群体确系由二、三倍体杂交得到的一个早世代稳定群体。


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