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大白菜和甘蓝型油菜AP2/ERF家族转录因子的克隆与分析

庄静  
【摘要】: 植物一生面临很多的生物和非生物胁迫,严重影响植物的生长发育,从而影响作物的产量。很多基因被这些胁迫诱导表达,以增强植物对逆境的抗性。转录因子是其中重要的一类调控基因,通过与顺式元件相互作用调节植物对各种环境胁迫的适应。AP2/ERF家族是植物中重要的一类转录因子,包含一个高度保守的AP2-DNA结合域,其基因编码的产物具有广泛的功能。 植物基因组分析是研究基因功能和基因进化的有效手段,目前植物基因功能解析很大程度上依赖模式植物拟南芥的研究信息。拟南芥、大白菜和油菜同属于十字花科,亲缘关系较为密切,因此可以利用拟南芥基因组研究的基因资源和生物信息资源,开展大白菜和油菜的功能基因组研究。本研究分析了大白菜和油菜一类重要的转录因子AP2/ERF,对于研究大白菜和油菜的逆境抗性、开花机制和果实发育等有重要的意义。 1、通过对大白菜EST数据库分析,使用拟南芥AP2/ERF家族转录因子氨基酸序列信息为探针,得到62个AP2/ERF家族基因。基于这些大白菜AP2/ERF家族转录因子的氨基酸序列,可以分为四个亚族(ERF、DREB、RAV和AP2),而且上述亚族的分类与拟南芥非常相似。进一步对大白菜AP2/ERF家族转录因子进行了一系列的生物信息学分析:cDNA和氨基酸序列、组成、理化性质、进化树、保守域序列和功能域。通过对EST数据进一步分析研究大白菜AP2/ERF家族转录因子的表达。研究发现,上述62个AP2/ERF转录因子家族成员在根中丰度最高,达到33%,接着是叶和种子,丰度均为21%。芽、花和长果角中的丰度相对较低,分别为:6%、8%和11%。大白菜AP2/ERF家族转录因子基因表达量最高的出现在根中,为BraERF-B2-5基因。 2、利用油菜UniGene数据库,通过电子克隆从一个UniGene中分离得到三个AP2/ERF转录因子(BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3)。BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3属于AP2/ERF家族转录因子ERF-B2亚族,是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与AtERF1相似。蛋白质无序化分析发现,油菜BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3无序化程度小于拟南芥AtERF1.通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜“沪油15”的DNA和cDNA中扩增了上述基因,初步分析BnaERF2没有内含子,BnaERF1和BnaERF3有内含子。另外,通过EST丰度分析显示,该类转录因子表达最高峰在种子中,其次为花,在芽、茎和分生组织中没有检测到表达。 3、以拟南芥AP2/ERF-B3亚族转录因子保守序列为信息探针,分离得到2个油菜AP2/ERF-B3亚族的转录因子BnaERFB3-1和BnaERFB3-2.通过PCR和RT-PCR方法从甘蓝型油菜“沪油15”的DNA和cDNA中克隆了上述基因。序列分析显示,克隆的BnaERFB3-1-Hy15和BnaERFB3-2-Hy15转录因子都没有内含子,BnaERFB3-1-Hy15和BnaERFB3-2-Hy15是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与AtERF5相似。BnaERFB3-1-Hy15和BnaERFB3-2-Hyl5蛋白无序化程度大于拟南芥AtERF5。EST丰度显示,BnaERFB3-1表达集中在种子中,而BnaERFB3-2表达集中在根中。另外,将上述基因分别构建入酵母表达载体和植物双元表达载体。 4、以拟南芥AP2/ERF-B4亚族转录因子保守序列为探针,分离得到一个UniGene (Bna.17538),进一步序列拼接得到一个油菜AP2/ERF-B4亚族转录因子BnaERFB4-1。分析结果显示BnaERFB4-1是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与拟南芥RAP2.6L非常相似,蛋白质无序化程度大于拟南芥RAP2.6L.通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜“沪油15”DNA和cDNA中分离了BnaERFB4-1基因。序列测定证实BnaERFB4-1-Hy15基因存在一个内含子。将BnaERFB4-1-Hy15基因通过Bam HI和Sac I酶切后分别插入酵母表达载体YK3302和植物双元表达载体pYF1404,构建了BnaERFB4-1-Hy15基因的酵母体内结合和植物转化载体。 5、以拟南芥CBF家族转录因子保守序列为信息探针,搜索油菜UniGene数据库,得到二个UniGene:Bna.2193和Bna.2260,序列拼接得到2个cDNA序列(BnaCBF-1和BnaCBF-2).通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜“沪油15”DNA和cDNA中克隆了上述基因。序列分析显示,“沪油15”的BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15基因都没有内含子。BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hy15转录因子属于AP2/ERF家族中的DREB-A1亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与AtCBF1相似。


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