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中国石蒜(Lycoris chinensis)体内加兰他敏等生物碱积累影响因素的研究

穆红梅  
【摘要】: 石蒜科(Amatyllidaccae)植物以含有独特的具有多种生物活性的生物碱化合物而为人关注。在这些生物碱中研究的最多的是加兰他敏。加兰他敏是一种异喹啉生物碱,也是乙酰胆碱酯酶抑制剂。研究发现其在治疗阿尔茨海默病(简称AD.老年性痴呆症早期症状)方面具有特殊的疗效,是目前世界上广泛应用的治疗轻至中度AD.的药品。 目前药用加兰他敏主要来源于两种途径:人工合成和从植物中提取。由于加兰他敏人工合成步骤复杂,成本很高,目前植物仍然是加兰他敏等生物碱的重要来源。但由于加兰他敏在石蒜中含量比较低,同时其市场需求量持续上升,自然资源已经难以满足人们的需求,而且长期挖掘自然资源必然会造成生态环境的破坏。如何对濒危野生石蒜属植物资源进行资源保护,如何提高石蒜体内加兰他敏和其它生物碱含量一直是药用植物研究领域的热点问题。本研究概述了世界各国利用生物工程技术的方法来提高加兰他敏等生物碱的研究现状,研究了中国特有种——中国石蒜(Lycoris chinensis)的种子贮藏萌芽特性,以及中国石蒜不同生长时间中,不同外植体来源的愈伤组织和芽中,以及部分生物和非生物诱导因素对中国石蒜体内加兰他敏、力克拉敏、石蒜碱、总生物碱含量的变化,并探讨了加兰他敏合成途径中的重要酶——编码儿茶酚氧位甲基转移酶的基因的表达量和加兰他敏含量之间的关系,主要结果总结如下: 1.探讨了适合于中国石蒜种子贮藏的最佳方法及种子萌芽的最佳条件。将新鲜中国石蒜种子(含水量72.37%)置于-80℃,-20℃,-4℃冰箱,硅胶,室温干燥贮藏一个月,测定其萌芽率,结果表明:新鲜中国石蒜不耐贮藏,在-80℃和-20℃,硅胶干燥贮藏一个月后很快失去发芽能力,室温(10℃-30℃)湿沙层积,-4℃湿沙贮藏,均可以保持其生活力。本试验结果表明,中国石蒜种皮对发芽有抑制作用,除去种皮后的种子萌芽时间缩短,萌芽率和萌芽势均显著高于带种皮的种子。中国石蒜种子发芽需要短暂时间的低温以完成春化作用,-4℃低温层积,GA3处理能缩短萌芽时间,使萌芽整齐。光照与黑暗对萌芽率没有显著影响。中国石蒜种子属于脱水敏感型,随着种子含水量的下降,种子的生活力也随之降低,临界含水量为51.10%,低于临界含水量其生活力迅速下降。中国石蒜种子属于低度顽拗性种子。 2.研究了中国石蒜生长时间中加兰他敏、力克拉敏、石蒜碱含量的变化。利用高效液相色谱(HPLC)对中国石蒜未萌发的种子,10天幼苗,3个月苗,1年生苗,多年生的中国石蒜植株的生物碱进行检测,结果表明,在中国石蒜10天幼苗中加兰他敏、力克拉敏、石蒜碱的含量最低。随着生长时间的增加,生物碱含量增加。多年生的石蒜中生物碱含量最高。中国石蒜不同器官中生物碱含量积累规律研究表明:石蒜种仁、种皮以及根中生物碱含量较高,成熟种子中加兰他敏含量最高(671.33μg/g DW).叶片中生物碱的含量最少。 3.分别以中国石蒜(Lycoris chinensis)的鳞茎、花序、种子为外植体,MS为基本培养基,比较了不同的灭菌时间,不同的取材时间,不同的激素配比,不同的蔗糖浓度对中国石蒜污染率,诱导率以及小鳞茎生长的影响。结果表明:鳞茎外植体用0.1%的氯化汞溶液灭菌12 min污染率下降为32%,外植体成活率为96%,效果最好。不同的取材时间研究表明第一次休眠期(5-7月)取材较为合适。不同的激素配比实验表明表明:MS+6-BA5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L是最佳的不定芽诱导培养基,最高诱导率达到100%,平均再生芽数为8.5个;中国石蒜的生根培养基为1/2MS+6-BA0.15-0.18 mg/L+IBA 1.5-1.0mg/L.不同的蔗糖浓度对中国石蒜鳞茎生长的影响表明:小鳞茎的直径的生长速度随着蔗糖浓度的升高而加快,在蔗糖浓度为90 g/L时,小鳞茎的直径增加最大,为对照(蔗糖浓度为30g/L)的2.7倍;小鳞茎高度随着蔗糖浓度的增加而减小 花序外植体用0.1%的氯化汞溶液灭菌13-14 min污染率下降为57%-42%,外植体成活率为66%-54%,为较适宜的灭菌时间。花序不同时期取材实验表明,在盛花期取材较为合适。不同的激素配比实验表明:MS+6-BA5.0-7.0 mg/L+NAA0.5 mg/L为比较适宜的中国石蒜花序诱导培养基。 去皮后的中国石蒜种子较容易灭菌,在10 min和11 min的灭菌条件下的污染率为22%和19%,成活率为93%和94%。因此去皮后的中国石蒜种子在0.1%的氯化汞灭菌时间为10-11 min为宜。把萌芽的种子接种到诱导培养基:MS+6-BA5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L上,诱导率达98%。 4.研究了中国石蒜的组织培养的不同分化状态对植株体内加兰他敏等生物碱含量的影响。愈伤组织诱导的最佳培养基为:MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L BA,诱导率为95.27%,愈伤组织鲜重达到1.72 g。分化培养基为MS+6-BA5.0 mg/L+NAA0.5 mg/L.本实验结果表明,中国石蒜组织培养的分化状态对生物碱的含量有很大影响,愈伤组织不含加兰他敏,胚状体和丛生芽中加兰他敏、石蒜碱、力克拉敏的含量都低于三个月实生无菌种子苗中的含量。本研究还探讨了由中国石蒜鳞茎、花序、种子诱导出的丛生芽的生长速度以及对植株体内加兰他敏等生物碱含量的影响。结果表明,不同的外植体来源的丛生芽的生长状况不同。由中国石蒜种子诱导的小鳞茎的直径增加最大,为由鳞茎诱导的小鳞茎的1.65倍。但是由鳞茎诱导的丛生芽分化的小鳞茎的数量最多,为由种子诱导的小鳞茎数的2.7倍。来自花序的丛生芽中加兰他敏的含量高于来自鳞茎和种子中加兰他敏的含量,但都低于三个月无菌种子苗中的含量,也低于多年生植株中的含量。 5.采用生物诱导子和非生物诱导子处理中国石蒜三个月的实生苗,考察其生物量和生物碱含量的变化情况。结果表明,甲基茉莉酸甲酯(MJ)在50、100、250μM处理时,以及水杨酸(SA) 0.25、0.5.1.0 mM浓度处理时,在对植物的生长有抑制作用,而酵母诱导物(YE)在0.05、0.10、0.15g/L时,一氧化氮(NO)在50、100、500μM处理时可以促进植物的生长。甲基茉莉酸甲酯(MJ)、一氧化氮(NO)和酵母诱导物(YE)可以促进加兰他敏的积累。在NO浓度为100μM处理10天的时候,加兰他敏的含量提高的倍数最多为对照的1.72倍。在酵母诱导物(YE)的浓度为0.01g/L处理10天的时候,石蒜碱的含量提高最多为对照的1.38倍。 6.克隆可能与加兰他敏生物合成相关的儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)基因的片段。该基因的定量RT-PCR分析表明,在花、花葶、鳞茎和根中,加兰他敏的含量与该部位COMT基因的表达量之间有一定的相关性,但并不完全一致。在花中COMT基因的表达量高于根及花葶,同时它的加兰他敏含量最高;而在花葶中加兰他敏含量最低,COMT基因表达丰度较高。因此儿茶酚氧位甲基转移酶与加兰他敏生物合成的关系还需要进一步的研究加以明确。


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