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芽孢杆菌及其脂肽类化合物防治植物病害和促进植物生长的研究

王帅  
【摘要】: 应用生防菌防治植物病害已经有很多年了,植物根围促生细菌(PGPR)能够防治各种真菌、细菌和病毒病害。PGPR防治植物病害的机制主要是通过与病原菌竞争营养和空间位点、产生抗生素抑制病原物的发展和诱导植物产生抗病性,另外,PGPR也能够通过产生一些植物激素或促进植物在土壤中吸收更多的矿物质、氮或钾而促进植物的生长。芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一类PGPR菌株,能够促进植物生长和防治植物病害。本文以芽孢杆菌为材料,对芽孢杆菌防治植物病害和促进植物生长的分子机理、芽孢杆菌产生脂肽类化合物的发酵条件和脂肽类化合物防治植物病害进行了系统研究,主要研究结果如下: 1.温室实验结果表明,在接种烟草花叶病毒(TMV)28天后调查发现,芽孢杆菌明显促进了烟草的株高和鲜重,并显著降低了TMV的发病程度。TMV在芽孢杆菌处理烟草叶片中的含量也明显低于对照。RT-PCR分析了烟草经芽孢杆菌处理后信号调节基因Coil、NPR1和防卫基因PR-la、PR-1b的表达情况,结果表明,芽孢杆菌能够诱导烟草产生诱导系统抗性(ISR)并伴随抗性相关基因的表达。RT-PCR还分析了两个调节植物细胞生长的扩张蛋白基因NtEXP2和NtEXP6,结果表明芽孢杆菌能够促进烟草生长可能是由于诱导了扩张蛋白基因的表达。此外,本实验还分析了烟草过敏性细胞坏死(HCD)标志基因hin1、hsr203的表达情况和烟草接种TMV后活性氧产生量的变化情况,结果表明芽孢杆菌处理后能够明显诱导基因hin1、hsr203的表达,以及在处理烟草接种TMV后活性氧的产生量明显高于对照。 2. HpaGxooc是由水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)产生的一种非特异性蛋白激发子,属于harpin蛋白家族。HpaGXooc能够激发非寄主植物的过敏性细胞坏死,诱导植物抗病、抗虫和抗旱,而且能够促进植物生长。芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一类非常重要的生防细菌,能够有效的防治植物病害和促进植物生长。为了进一步提高芽孢杆菌的拮抗性能,获得更好的生防效果,我们运用基因工程的方法将HpaGxooc蛋白编码基因转化B. subtilis OKB105,并得到了基因工程菌株OKBHF.在本研究中我们旨在了解基因工程菌株OKBHF是否比原始菌株OKB 105有更好的生防功能和促生作用。温室试验结果表明,在接种黄瓜花叶病毒(CMV)28天后,OKBHF处理的番茄与OKB105和其他芽孢杆菌菌株处理的番茄相比,明显促进了番茄的株高、鲜重和花果数,CMV的病害严重度也明显降低。分别在接种14、21和28天后调查发现,与OKB105和其他芽孢杆菌处理相比,OKBHF处理明显降低了番茄叶内的病毒含量。此外,RT-PCR实验表明,OKBHF和OKB 105都能够诱导番茄中扩张蛋白基因LeEXP2. LeEXP5和LeEXP18, Pti激酶基因Pti4和Pti6,调控基因NPR1,以及效应基因PR-1a的增强表达,但是OKBHF诱导番茄各基因的表达量要明显高于OKB105.通过本试验我们发现,将HpaGxooc蛋白编码基因转化B. subtilis OKB 105得到的基因工程菌株OKBHF能够更好的诱导植物抗病性和促进植物生长,在农业生产上具有巨大的应用潜力。 3.以枯草芽孢杆菌G1为出发菌株,研究了发酵过程中不同培养条件和不同培养基对G1菌株产生脂肽类抗生素的影响。结果表明:最有利于脂肽类抗生素产生的发酵条件是初始pH 7.0,接种量3%,发酵培养温度30℃,发酵时间38 h时,而最佳培养基为Landy培养基。在提取脂肽类抗生素粗提物的过程中发现,加酸至pH 4.0时脂肽类抗生素几乎能够完全沉淀。在Landy培养基和上述发酵条件下,最多能产生脂肽类抗生素粗提物6.5 g/L。利用HPLC技术对产生的脂肽类抗生素进行定量分析,结果表明产生的纯脂肽类抗生素最高达2.4 g/L。 4.以枯草芽孢杆菌G1为出发菌株,通过30 L、1000 L发酵罐的中试发酵试验和HPLC分离纯化方法,最终确定了工业化中试发酵G1菌株的最佳发酵条件:在玉米培养基条件下,初始pH 7.0,种子菌经平板活化,再经一、二级种子菌放大,以3%的接种量转接入发酵罐,容氧率为30%、搅拌速度由容氧率控制,30℃培养38 h,最多能产生脂肽类抗生素粗提物5.4 g/L。利用HPLC技术对产生的脂肽类抗生素进行定量分析,结果表明产生纯的脂肽类抗生素达1.35 g/L。 5.脂肽类化合物是由枯草芽孢杆菌(B. subtilis)产生的天然抗菌物质,包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和泛革素(fengycin).其中surfactin不仅是高活性的表面活性剂,同时也是具有广泛用途的生物活性物质,表现出抗病毒、抗肿瘤和抗支原体活性。而iturin和fengycin具有强抗真菌活性,抗菌谱广.脂肽类生物农药是由本实验室研究开发的,并获得一项发明专利“枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药和应用”。在大棚和田间小区条件下测定了脂肽类生物农药对病毒病害和真菌病害的防治效果,探索脂肽类生物农药在生物防治中的应用前景。实验结果表明,在温室大棚内,脂肽类生物农药G1对辣椒病毒病有较好的防治效果,防效达74.2%,脂肽类生物农药B3对辣椒灰霉病和黄瓜霜霉病有较好的防效,防效为56.3%和52.0%。同时脂肽类生物农药G1和B3也能促进辣椒和黄瓜的生长并能够提高辣椒叶绿素的含量。另外,在田间实验小区,脂肽类生物农药B3和G4对油菜菌核病也有一定的防治效果,防效为37.3%和31.4%,并能够促进油菜的生长。


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