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运输应激对猪免疫机能的影响及其调控机理初探

吕琼霞  
【摘要】: 近年来,随着养猪业集约化程度的不断提高,猪的长途运输也越来越普遍,随之而来的是运输应激给猪带来的一系列不良影响,比如运输途中猪的猝死。研究表明,猪在运输途中的死亡直接与运输应激对其免疫功能的抑制有关。通过神经-内分泌-免疫网络的作用,应激能够影响动物免疫系统的机能。本实验将从细胞因子的角度探讨运输应激对猪免疫机能的影响及其调控机理。 试验将在相同环境中饲养的19头皮特兰和二花脸杂交二代猪(体重:50±2 kg,饲养于江苏省农科院)随机分为A-D4组。试验当日,对照组猪(A组,4头)处于正常饲养环境,运输组(均为5头)早上7:00开始运输,并分装在2个独立的木制箱子中,每箱分别为2头和3头,然后用动物运输车辆分别进行1 h(B组)、2 h(C组)和4 h(D组)的运输应激,路途运输模拟国内普通等级公路的运输状况(当时室外温度为18-25℃),速度控制在30-40 km.h-1,整个过程没有饮水和喂食。对运输应激到试验设定时间的试验猪进行及时剖杀,采取血液,分离血清用于淋巴细胞增殖指数和细胞因子动态变化的定量检测;采取肠系膜淋巴结、脾脏和胸腺组织各一份,固定于4%多聚甲醛,用于NF-κB激光扫描共聚焦显微镜的定位检测;同样取两份组织样品用液氮速冻后,冻存于-80℃冰箱,用于P38MAPK和细胞因子mRNA的定量检测;探讨运输应激猪外周血淋巴细胞增殖指数、血清中细胞因子含量及免疫器官中细胞因子mRNA表达之间的相关性,找出运输应激过程中影响免疫机能的关键性细胞因子,并初步了解它的调控机制。 为了总体评价运输应激对猪体液免疫和细胞免疫功能的影响,将不同运输时间的猪血清稀释后单独或与植物血凝素A (PHA)和脂多糖(LPS)分别刺激正常猪外周血淋巴细胞,用噻唑蓝(MTT)比色分析法分别检测淋巴细胞增殖指数,结果表明:运输1h猪血清在1:16,1:32和1:64稀释时均能提高正常猪外周血淋巴细胞增殖率,且达到峰值,但与对照组比较,无统计学差异(P0.05);随后淋巴细胞转化能力开始下降,到4 h时降到最低,且和运输1 h相比呈显著下降(P0.05)。对于同一种稀释度的血清,加入PHA和LPS后都能显著的增强正常猪外周血T、B淋巴细胞的增殖活性(P0.01);相对于对照组,1:32稀释的血清和PHA共同作用,在运输1 h时可显著增强外周血T淋巴细胞的增殖活性(P0.05)。其余运输不同时间段的不同稀释度的血清和对照组相比无显著性差异;对于不同的运输时间,均是在运输1 h时T淋巴细胞的增殖活性最强,达到最大值,然后迅速下降,到4h时降到对照组值之下,且1:16和1:32两种稀释血清运输1 h组和4 h组之间均呈现显著性差异(P0.05)。相对于对照组,1:32稀释运输1 h的血清和LPS共同作用时可显著的增强外周血B淋巴细胞的增殖活性(P0.05)。1:16和1:64两种稀释度血清在运输前后和运输过程中对B淋巴细胞增殖均无显著性影响。 为了探讨运输应激对猪血清T、B淋巴细胞增殖效应影响的机理,用ELISA方法分别检测试验猪血清中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α含量的动态变化,结果显示:血清中IL-2、IL-6、IL-10的含量变化均是在运输后1 h时达到最高,随后开始下降但仍然高于对照组,并在4 h时降到最低。其中IL-6、IL-10在4 h时和对照组相比呈极显著的下降(P0.01),IL-2在4 h和1 h相比也呈现显著性下降(P0.05),IL-1β、IL-4及TNF-α三种细胞因子含量运输前后和运输过程中均没有显著性的变化。提示运输应激对体液免疫和细胞免疫均有影响,即Th1和Th2类细胞因子均有明显的应答反应,运输应激过程中猪免疫机能状态取决于二者的动态平衡。 为了解在运输应激血清中变化显著的三种细胞因子(IL-2、IL-6和IL-10)动态变化的机理,利用实时荧光定量RT-PCR技术,对运输应激猪3种主要免疫器官(肠系膜淋巴结、脾脏和胸腺)中IL-2、IL-6和IL-10及其相应受体mRNA表达水平进行检测。结果显示:经1 h、2 h和4 h的运输应激后,肠系膜淋巴结中三种细胞因子的表达在运输前后和运输过程中均发生了显著的变化,且均是4 h时达到最大值,并显著的高于对照组、1 h组和2 h组(P0.01);受体mRNA也发生了显著变化,但趋势和细胞因子的表达不尽相同;脾脏中IL-10mRNA、IL-6mRNA、IL-6RmRNA及IL-10RmRNA的表达亦发生了显著的变化;在胸腺中,除了IL-6RmRNA外,三种细胞因子mRNA及IL-2RmRNA, IL-10RmRNA在运输前后和过程中均有显著变化。因此,猪在运输应激过程中,不同免疫器官细胞因子及其受体的表达不尽相同,而血清中细胞因子含量的变化是三种免疫器官共同调控的结果。 为找到运输应激过程中导致猪免疫机能变化的主要调节物,使用SPASS分析软件中的单尾分析法对淋巴细胞增殖效应及血清中细胞因子含量以及与各免疫器官中细胞因子及受体表达之间的关系进行皮尔森相关系数分析。结果显示:猪血清中IL-6含量的变化与运输猪血清1:32稀释时T、B淋巴细胞转化率的相关系数分别为0.823和0.764,血清中IL-10含量的变化与运输猪血清1:32稀释时T淋巴细胞转化率的相关系数为0.789,且统计学上均呈现极显著的差异(P0.01)。在肠系膜淋巴结中,IL-6mRNA水平与血清中IL-10含量呈明显负相关(r=-0.719,P=0.004), IL-2mRNA的表达也与血清中IL-10含量呈明显负相关(r=-0.720,P=0.004);在脾脏中,IL-6mRNA水平与血清IL-6含量又明显正相关(r=0.669,P=0.009),且IL-6mRNA的表达和血清中的IL-10也存在明显的正相关(r=0.663,P=0.009);在胸腺中,IL-10mRNA和IL-10RmRNA水平与血清中IL-10含量分别呈明显正相关(r=0.712,P=0.000),IL-6mRNA的表达和IL-2mRNA也存在明显的正相关(r=0.768,P=0.000)。统计学分析表明:IL-6可作为猪运输后免疫功能变化的标志物,且胸腺和脾脏分别是调节IL-10和IL-6的重要免疫器官,而肠系膜淋巴结则对IL-10起负反馈的调节作用。 为探讨猪运输应激过程中免疫器官对各种细胞因子表达的调控,运用ELISA方法对运输应激猪肠系膜淋巴结、脾脏和胸腺细胞中P38MAPK进行定量检测,运用激光扫描共聚焦显微镜对NF-κB在三种免疫器官中进行表达和定位的检测。结果显示:胸腺中,P38MAPK的表达在运输后2 h显著高于1 h组、4 h组和对照组(P0.05);肠系膜淋巴结和脾脏运输前后和过程中P38MAPK的表达均没有发生显著的变化。三种免疫器官中的NF-κB,在运输前后的胞浆和胞核中均有分布,但分布率不尽相同,阳性细胞数均随着运输时间的延长逐渐增加,4 h时达到最大值;NF-κB的入核率也随着运输时间的延长而增高,运输后4 h达到最大值,与阳性细胞数的变化趋势相同。上述结果表明,P38MAPK-NF-κB是猪运输应激过程中调控免疫器官细胞因子表达的重要信号系统。 以上试验研究结果表明:运输应激对猪免疫机能的影响存在时间效应,运输1 h、2 h可使免疫机能代偿性的增强,运输4 h时引起机体的免疫抑制。统计学分析结果显示,IL-6可作为猪运输后免疫功能变化的标志物,在三种免疫器官中,胸腺和脾脏分别对应激过程中IL-10和IL-6的分泌起重要调节作用,而肠系膜淋巴结则对上述两种细胞因子起负调节作用。P38MAPK-NF-κB是猪运输应激过程中调控免疫器官细胞因子表达的重要信号系统。


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