1. 小鼠坐骨神经缺损后腓肠肌Myostatin的表达变化 2. Myostatin siRNA干扰效率的验证

【摘要】： 目的分析Myostatin在腓肠肌失神经萎缩过程中的表达变化，探讨Myostatin在神经缺损引起肌萎缩过程中的作用。 方法以坐骨神经横断术制备小鼠腓肠肌失神经支配模型，采用实时荧光定量PCR和Western Blot分别检测失神经支配不同时间腓肠肌Myostatin及其mRNA，Smad2、磷酸化Smad2的变化，同时对肌肉湿重比、肌纤维横截面积(CSA)及形态学特征进行了分析比较。 结果失神经支配早期，腓肠肌Myostatin mRNA和相应蛋白水平迅速上升，分别在3天和7天达到高峰，随后逐渐下降；在此过程中腓肠肌磷酸化Smad2蛋白表达水平与Myostatin mRNA类似，而腓肠肌失神经支配后，湿重比、肌横截面积相应减少。 结论腓肠肌失神经肌萎缩过程中，Myostatin基因及蛋白表达均有变化，提示Myostatin在其中扮演重要角色，并且通过TGF-β／Smad通路介导信号传递。 目的制备小鼠Myostatin RNAi质粒，研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞中的沉默作用。 方法根据Myostatin mRNA序列，选择3个19nts的靶序列，设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链，退火后插入pSilencer2.0-U6表达载体，构建3个RNAi阳性质粒：M1／pSilencer、M2／pSilencer、M3／pSilencer及一个阴性质粒Mc／pSilencer并转染C2C12细胞，然后采用Western blot观察RNAi对C2C12细胞中Myostatin表达的抑制作用。 结果酶切鉴定和测序结果证实，4个RNAi质粒构建正确，其中M1／pSilencer质粒能降低C2C12细胞中Myostatin表达量，有统计学差异，表达量约降低40％。 结论构建的阳性RNAi质粒能抑制目的基因Myostatin在C2C12细胞中的表达。