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壳聚糖材料与海马神经元生物相容性的体外培养研究

贺倩茹  
【摘要】:目的探讨壳聚糖(chitosan)生物材料与原代培养的大鼠海马神经元(hippocampal neurons)的体外生物相容性,为壳聚糖材料作为基础的支架用于中枢神经系统损伤后神经组织移植治疗提供科学依据。 方法 1、以体外原代培养的胎鼠海马神经元为研究对象,NF-200细胞免疫荧光染色鉴定贴壁培养的大鼠海马神经元后,通过光镜,扫描电镜,透射电镜,细胞免疫荧光染色法(NF-200,β-tubulin III, GAP-43, MAP-2)观察原代培养的海马神经元在壳聚糖纤维上的黏附、生长及蛋白的表达分布情况。 2、采用MTT法检测以壳聚糖纤维浸出液培养不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h)海马神经元细胞活力的变化。 3、通过Western blot方法检测以壳聚糖纤维浸出液培养不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h)对海马神经元生长相关蛋白-43(GAP-43)和微管蛋白(β-tubulin III)表达的影响。 4、通过光镜,扫描电镜,透射电镜,细胞免疫荧光染色法(NF-200,β-tubulin III, synaptophysin)观察原代培养的海马神经元在壳聚糖膜上的黏附、生长、蛋白表达分布情况。采用Leica Qween软件分别测量在多聚赖氨酸包被玻片和壳聚糖膜上培养的海马神经元神经突起平均长度和总长度。 5、采用MTT法检测以壳聚糖膜浸出液培养不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h)海马神经元细胞活力的变化。 6、通过Western blot方法检测以壳聚糖膜浸出液培养不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h)对海马神经元生长相关蛋白-43(GAP-43)和微管蛋白(β-tubulin III)表达的影响。 结果 1、体外分离培养的大鼠海马神经元NF-200细胞免疫荧光染色鉴定纯度达96.3%。光镜,扫描电镜,细胞免疫荧光染色(NF-200,β-tubulin III, GAP-43, MAP-2)结果表明海马神经元可以在壳聚糖纤维上较好的黏附,生长,细胞形态及神经元特异性标记蛋白的表达均正常。透射电镜结果表明海马神经元贴附于壳聚糖纤维生长,细胞内部超微结构正常。 2、MTT结果显示,海马神经元在壳聚糖纤维浸出液中的细胞活力与神经元培养基组,羟基磷灰石浸出液组无统计学差异,而有机锡浸出液组细胞活力随着时间的延长与其余各组相比均有明显下降。 3、Western blot结果显示,壳聚糖纤维浸出液组与神经元培养基组相比海马神经元生长相关蛋白-43 (GAP-43)和微管蛋白(β-tubulin III)两种蛋白的表达无统计学差异。 4、光镜,扫描电镜,细胞免疫荧光染色(NF-200,β-tubulin III, synaptophysin)结果表明海马神经元可以在壳聚糖膜上黏附,生长良好,细胞形态及神经元特异性标记蛋白的表达均正常。透射电镜结果表明海马神经元细胞内部超微结构正常。Leica Qween软件分别测量在多聚赖氨酸包被玻片和壳聚糖膜上培养的海马神经元神经突起的平均长度和总长度,结果无统计学差异。 5、MTT结果显示,海马神经元在壳聚糖膜浸出液中的细胞活力与神经元培养基组,羟基磷灰石浸出液组无统计学差异,而有机锡浸出液组细胞活力随着时间的延长与其余各组相比均有明显下降。 6、Western blot结果显示,壳聚糖膜浸出液组与神经元培养基组相比海马神经元生长相关蛋白-43(GAP-43)和微管蛋白(β-tubulin III)两种蛋白的表达无统计学差异。 结论 1、壳聚糖生物材料与原代培养的海马神经元具有良好的生物相容性,在材料上培养的神经元其细胞表型和细胞功能都没有改变。 2、在壳聚糖材料浸出液中培养的海马神经元的形态及细胞活力无改变,神经元生长过程中表达的重要蛋白GAP-43和β-tubulin III蛋白的表达均无改变,表明壳聚糖材料对原代培养的海马神经元无细胞毒性作用,为其将来应用于中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础。


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