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多疣壁虎α型降钙素基因相关肽(α-CGRP)基因的克隆及其表达分析

任丽洁  
【摘要】:目的:克隆壁虎α型降钙素基因相关肽(α‐CGRP)基因的全长序列;研究α‐CGRP在壁虎断尾损伤后脊髓再生过程中的表达变化;运用原位杂交的方法观察α‐CGRP在脊髓中的定位;通过瞬时转染的方法研究壁虎α‐CGRP肽在壁虎Gsn1细胞中的定位。 方法:应用Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)技术从壁虎脑和脊髓组织中获得α‐CGRP的cDNA全长序列;Northern Blot验证其转录本的大小;制备壁虎断尾损伤模型,采用RT-PCR方法检测该基因在壁虎断尾后在中枢神经系统中的表达变化;通过原位杂交方法检测CGRP mRNA在壁虎正常脊髓以及损伤模型断端下段(近侧)脊髓中的表达分布;通过真核转染将壁虎的野生型CGRP重组质粒转染至壁虎Gsn1细胞系内,观察CGRP肽在细胞中的定位。 结果: (1)RACE方法获得α‐CGRP cDNA全长1002 bp,ORF区编码124个氨基酸,其中成熟肽由37个氨基酸组成,与斑马鱼的同源性为86.5%,与哺乳类动物80%左右,而与鸡的亲源性最高,为94%。 (2)Northern blot和RT-PCR结果显示,α‐CGRP转录本大小约为1.0kb,在脑、卵巢、肌肉、肾、肝、肺和睾丸中均有低表达,而在脊髓中的表达丰度最高。 (3)脊髓原位杂交结果显示,α‐CGRP mRNA阳性信号主要分布于脊髓灰质中,白质中少量表达,且前角细胞表达量多于后角细胞,室管膜周围细胞表达丰度也较高;断尾损伤1d后阳性信号明显增强,室管膜周围细胞和前后角细胞中的表达量均高于正常;损伤后2w阳性信号有所减少。 (4)运用RT-PCR检测方法结果表明,壁虎断尾损伤1d后断端近侧脊髓中mRNA表达呈明显上升趋势且转录水平最高,3d后稍有下降,但仍在正常水平之上,1w、2w后逐渐下降。 (5)真核转染壁虎Gsn1细胞株发现,α‐CGRP肽定位于整个细胞中。 结论: (1)本试验克隆得到了壁虎α‐CGRP cDNA的全长序列。壁虎α‐CGRP ORF区编码124个氨基酸,其中1-16位氨基酸是信号肽,成熟肽由37个氨基酸组成。 (2)α‐CGRP在壁虎中的转录本大小为1.0 kb。 (3)α‐CGRP在壁虎各组织中广泛分布,其中脊髓中表达量最高。 (4)壁虎的α‐CGRP肽在Gsn1细胞中定位于整个细胞。 (5)壁虎断尾损伤后α‐CGRP在断端近侧脊髓中的表达,1d时明显上调,神经系统合成分泌的CGRP可能参与调节免疫反应或伤口愈合。


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