microRNA在肾间质纤维化中作用的研究

【摘要】： 1.肾小管上皮-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肾间质纤维化的关键致病机理。目前肾小管EMT的调控机制仍不十分明确。近来微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)在EMT中的作用备受国内外关注。我们借助miRNA芯片研究单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstraction UUO)大鼠病变侧肾脏miRNA的差异表达,筛选可能与肾小管EMT相关的miRNA。 2.观察miR-200家族在转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导的NRK-52E (normal rat kidney epithelial cell)细胞转分化中的作用,探讨miR-200参与调控肾小管EMT的机制。 3.观察miR-21在慢性肾脏纤维化中的作用,寻找miR-21参与调控肾小管EMT的可能的靶点。 1.选用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠作为研究对象,建立UUO动物模型,分别于术后不同时间点处死大鼠,留取病变侧肾脏。采用哺乳动物miRNA芯片筛选出差异表达显著的miRNA,用Significance Analysis of Microarrays(SAM)软件分析microarray结果,实时定量PCR (Real-time PCR)技术验证芯片结果。Western Blot法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙粘素(E-cadherin)等的蛋白表达水平变化。采用NIH图像分析程序分析杂交的信号强度,SigmaStat软件进行统计分析实验结果,SigmaPlot软件表达结果。 2.应用microarray芯片、Real-time PCR检测肾组织中miR-200家族的表达;同时分析miR-200家族的表达与肾间质纤维化之间的关系。体外实验以NRK-52E细胞株为研究对象,用TGF-β1处理不同时间后,应用Real-time PCR技术检测miR-200家族的表达;以免疫印迹、间接免疫荧光染色等方法检测EMT相关指标的变化;分析miR-200家族与上述指标表达变化之间的关系。利用基因转染技术使NRK-52E高表达或抑制miR-200家族的表达,在此基础上,给或不给TGF-?β1处理,检测EMT相关指标的变化,以评价miR-200家族表达变化对于各种肾小管EMT相关指标的影响。转染ZEB siRNA,探讨miR-200参与EMT的靶点。 3.应用microarray芯片、Real-time PCR检测肾组织中miR-21的表达;同时分析miR-21的表达与肾间质纤维化之间的关系。体外实验以NRK-52E和NRK-49F细胞株为研究对象,用TGF-β1处理不同时间后,应用Real-time PCR技术检测miR-21的表达;以免疫印迹、间接免疫荧光染色、凝胶酶谱法分析等方法检测EMT相关指标的变化;分析miR-21与上述指标表达变化之间的关系。利用基因转染技术使细胞高表达或不表达miR-21,在此基础上,给或不给TGF-β?1处理,检测EMT相关指标的变化。 1.1 UUO可以成功建立慢性肾脏纤维化动物模型。与Sham组相比,UUO模型组肾组织中E-cadherin表达降低,α-SMA表达增多,其均随UUO时间延长而加重。 1.2 microarray芯片显示,和Sham组相比,UUO组肾组织45个miRNA的表达存在显著差异;其中表达上调的有19个,表达降低的有26个。 1.3在UUO不同时间点中,miR-18a和miR-21表达增高呈持续状态;表达持续降低的miRNA有miR-130b、miR-29c、miR-200a、miR-30c、miR-451。对miR-21、miR-451在梗阻肾中的表达进行了Real-time PCR定量检测,结果显示miRNA的表达趋势与芯片结果相符。 2.1 SD大鼠的UUO肾组织中miR-200a和miR-141表达降低;在TGF-β1诱导NRK-52E发生EMT的过程中,miR-200家族的表达也发生下调。 2.2运用基因转染技术上调miR-200家族的表达能抑制TGF-β1诱导的EMT;反之,转染miR-200的抑制剂能诱导EMT的发生。 2.3改变miR-200家族的表达的表达能影响ZEB1和ZEB2的mRNA及蛋白质水平;用siRNA转染下调ZEB1和ZEB2的表达能阻断miR-200抑制剂诱导的小管上皮细胞表型转变。 2.4过表达抑制性smad7,能完全阻断TGF-β1诱导的miR-200家族的表达下降。 3.1 SD大鼠的UUO肾组织中miR-21表达增加;在TGF-β?1诱导的NRK-52E发生EMT的过程中,miR-21的表达也明显上调。 3.2运用基因转染技术下调miR-21的表达能抑制TGF-β?1诱导的EMT;反之,转染miR-21的类似物能诱导EMT的发生。 3.3改变miR-21的表达水平对PTEN的mRNA没有明显影响,但是能影响它的蛋白质水平。 3.4运用基因转染技术下调miR-21的表达能抑制TGF-β?1诱导的NRK-52E细胞Akt的磷酸化。 1. UUO动物模型中miR-18a和miR-21表达增高呈持续状态;表达持续降低的miRNA有miR-130b、miR-29c、miR-200a、miR-30c、miR-451。这为研究miRNA在肾小管EMT中的作用做了初步的筛选。 2. EMT的体内和体外模型中,miR-200家族的表达均明显降低;miR-200的类似物能阻断TGF-β1诱导的EMT,反之,miR-200的抑制剂和TGF-β1作用相似;ZEB1和ZEB2可能是miR-200参与调节EMT的靶点;TGF-β1通过smad途径介导miR-200的表达。 3. EMT的体内和体外模型中,miR-21的表达均明显升高;miR-21的抑制剂能阻断TGF-β1诱导的EMT,反之,miR-21的类似物和TGF-β1作用相似; PTEN可能是miR-21参与调节EMT的靶点。