VEGF165和Angiopoietin-1在缺血心肌特异表达治疗急性心肌梗死研究

【摘要】： 背景:血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165, VEGF165)和血管生成素-1(angiopoietin-1, Ang1)是重要的治疗心肌梗死的生血管因子,在心脏过表达VEGF165和Ang1可改善缺血性心脏的功能。但未经调控的生血管因子的过表达会产生副作用,如血管瘤形成、视网膜病变、关节炎等。因此,生血管因子的表达调控已成为新的研究热点。 目的:通过肌球蛋白轻链-2v (cardiac myosin light chain 2v, MLC-2v)启动子和9个重复序列缺氧反应元件(hypoxia-responsive element, HRE)调控VEGF165和Ang1特异性表达于梗死心肌,增加治疗效果并减少副作用。 方法:永久结扎中华小型猪冠状动脉左前降支,构建心肌梗死模型。通过冠状动脉造影和心电图验证动物模型构建是否成功。使用腺相关病毒1 (adeno-associated virus 1, AAV1)作为基因载体,构建AAV1-MLCVEGF165、AAV1-MLCAng1和AAV1-LacZ载体系统。将AAV-MLCVEGF和AAV-MLCAng1分6点心肌局部注射到梗死心肌(治疗组),相同剂量的AAV-LacZ(LacZ组)和生理盐水(Saline组)心肌局部注射到对照组动物模型梗死心肌。聚合酶链式反应(PCR)检测VEGF在心脏、肝脏、肺、肾脏转导效果。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测VEGF165和Ang1在主要脏器和血液中的表达。使用门控单光子发射计算机成像仪(Gated-Single Photon Emission Computed Tomography, G-SPECT)检测心肌灌注和心脏功能。 结果:冠状动脉造影和心电图显示:结扎冠状动脉左前降支成功构建猪急性心肌梗死模型。PCR结果显示,AAV1携带的目的基因整合到心脏和肝脏组织。RT-PCR、Western blot和ELISA结果表明VEGF165和Ang1高表达在治疗组心肌梗死区和梗死心肌移行区。G-SPECT检测结果表明治疗组心脏功能和心肌灌注明显好于对照组。 结论:冠状动脉左前降支永久结扎法成功构建急性心肌梗死模型。通过MLC-2v启动子和9个重复HRE序列可调控VEGF165和Ang1在缺血心肌的特异高表达,VEGF165和Ang1在心肌缺血区的特异高表达能改善急性心肌梗死猪心肌灌注和心功能。 背景:VEGF165和Ang1是最常用的血管生成因子,可通过促进血管新生、抗心肌细胞凋亡改善缺血心脏心肌灌注和心脏功能。已有研究表明,bFGF、Akt、cyclin A和cycling D1均有促心肌细胞增生作用。但VEGF165和Ang1是否能促进心肌细胞增生,目前仍不清楚。 目的:阐明hVEGF和hAng1在缺血心肌特异表达改善心肌灌注和心脏功能的机制,分析hVEGF165和hAng1特异表达促进血管新生、抗心肌细胞凋亡和促进心肌细胞增生的作用。 方法:通过Lectin、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)荧光染色,比较治疗组和两对照组Lectin阳性血管密度和α-SMA阳性血管密度。Lectin和Ki67荧光双染,检测Ki67阳性血管数。流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,肌小结α-肌动蛋白(sarcomericα-actinin)和Ki67荧光双染检测Ki67阳性心肌细胞数,Western blot分析VEGF和Ang1抗心肌细胞凋亡的作用途径。流式细胞仪检测心肌细胞周期,Western blot和免疫共沉淀分析VEGF和Ang1促进心肌细胞增生的途径。 结果:VEGF/Ang1治疗组和LacZ组、生理盐水组比较,Lectin阳性血管密度和α-SMA阳性血管密度明显增高,Ki67阳性血管数也明显增多。流式细胞术结果显示,VEGF/Ang1治疗组凋亡心肌细胞明显减少;VEGF/Ang1治疗组Caspase-3、Bad表达明显低于LacZ组和生理盐水组,而p-Akt、Bcl-xL表达明显高于LacZ组和生理盐水组,Akt、Bcl-2、ERK1/2表达三组间无差异。细胞周期检测结果表明,VEGF/Ang1治疗组有更多的心肌细胞处于增殖期-S期,在VEGF/Ang1治疗组Ki67阳性心肌细胞数明显增高;进一步对细胞增殖途径分析发现,VEGF/Ang1治疗组p27表达明显低于LacZ组和生理盐水组,cyclinD2、cyclinA、cdk2、cdk4表达在VEGF/Ang1治疗组明显增高。 结论:VEGF和Ang1在缺血心肌中特异表达,促进血管新生,改善急性心肌梗死心肌灌注;通过p27、cyclinD2、cyclinA、cdk2、cdk4介导促进心肌细胞增殖,通过Akt、Bcl-xL、Bad途径抗心肌细胞凋亡,改善心脏功能。