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脂多糖预处理对骨髓间充质干细胞移植效率的影响及机制探讨

姚永伟  
【摘要】:目的:分离、培养和鉴定骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),研究其特征和向心肌细胞分化的能力。 方法:严格无菌条件下从C57BL/10J小鼠的股骨获取全骨髓细胞,进行体外培养,对贴壁细胞进行传代。观察贴壁细胞的生长状况和形态特征,并应用流式细胞仪对培养的第3-4代贴壁生长细胞的表面抗原(CD)进行表型分析,以鉴定是否为MSCs;并诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向分化,检验其多向分化能力。以10μmol/L 5-氮胞苷(5-Azacytidine , 5-Aza)与MSCs共孵育24小时,继续培养4周,采用免疫细胞化学法检测MSCs经5-氮胞苷诱导后心肌特异性蛋白(心肌肌钙蛋白I)的表达,研究体外培养的MSCs向心肌细胞分化的能力。 结果:从实验小鼠骨髓获取的贴壁生长的成纤维样细胞可多次传代,并保持其快速增殖特点。流式细胞术检测显示,培养的第3代贴壁生长的成纤维样细胞呈CD14(-),CD34(-),CD45(-),而CD29(+),CD44(+),CD105(+),符合骨髓间充质干细胞特点。在体外,骨髓间充质干细胞能向脂肪细胞、成骨细胞方向分化。以5-氮胞苷(10μmol/L)孵育24小时后再继续培养4周,可分化为表达心肌特异性蛋白(心肌肌钙蛋白I)的细胞。 结论:可通过对贴壁生长细胞反复传代培养的方法从全骨髓细胞中分离、纯化骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有贴壁生长、快速增殖的特性,在体外可多次传代而保持其特性。体外培养的骨髓间充质干细胞可被诱导向脂肪细胞和成骨细胞方向分化,并可被5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞,提示骨髓间充质干细胞有分化为心肌细胞的潜能,可作为急性心肌梗死后细胞移植治疗的细胞资源。 目的:在细胞水平研究脂多糖(Lipoplysaccharide, LPS)对MSCs增殖以及对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)释放的影响,并探讨Toll样受体4/核因子-κB ( toll-like receptor 4/nuclear factor—κB, TLR4/NF-κB)信号通路对MSCs增殖和分泌VEGF的作用。 方法:①取第3代野生型小鼠骨髓间充质干细胞(wild-type MSCs, wMSCs)和TLR4基因缺陷型小鼠骨髓间充质干细胞(TLR4 gene deleted MSCs, tMSCs)与不同浓度的LPS(0μg/ml,0.01μg/ml,0.1μg/ml,1.0μg/ml,10μg/ml)进行共培养,48小时后,用MTT法检测MSCs的增殖。②取第3代wMSCs,与不同浓度的LPS(0μg/ml,0.01μg/ml,0.1μg/ml,1.0μg/ml,10μg/ml)进行共培养,48小时后,用ELISA法检测细胞培养液上清中VEGF浓度。③将培养的细胞分为4组:1. wMSCs组;2. wMSCs+1.0μg/ml LPS组;3. wMSCs+ 1.0μg/ml LPS+四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组;4. tMSCs+ 1.0μg/ml LPS组。用ELISA法检测各组细胞培养液上清中VEGF浓度,RT-PCR法检测各组细胞中VEGF的mRNA含量。 结果:①不同浓度的LPS均能够促进wMSCs增殖,其中1.0μg/ml的LPS作用最强,LPS不能促进tMSCs增殖。②不同浓度的LPS均能够促进wMSCs旁分泌VEGF,其中1.0μg/ml的LPS作用最强。③用TLR4基因缺陷的MSCs或用NF-κB抑制剂后,VEGF的mRNA和蛋白表达量均减少。 结论:1.0μg/ml的LPS能够最大限度的促进MSCs增殖,促进MSCs旁分泌VEGF。用TLR4基因缺陷的MSCs或用NF-κB抑制剂后,VEGF分泌量减少。说明LPS是通过TLR4/NF-κB信号通路促进MSCs旁分泌VEGF的。 目的:研究C57BL/10J雄性小鼠的MSCs经LPS预处理后,能否改善心肌梗死大鼠的心功能,并探讨其中可能机制。 方法:用结扎冠状动脉前降支的方法制作大鼠的急性心肌梗死模型,80只Wistar雌性大鼠随机分为4组,各组大鼠分别在心肌内注射下列物质:30μlPBS(对照组),3×106个野生型MSCs/30μl (wMSCs移植组),3×106个1.0μg/ml LPS预处理的野生型MSCs/30μl (LPS-wMSCs移植组), 3×106个1.0μg/ml LPS预处理的TLR4基因缺陷型MSCs/30μl (LPS-tMSCs移植组)。3周后,用心脏超声心动图测定检测大鼠的心功能,TTC法检测心肌梗死面积,Masson′s染色法检测心肌纤维化程度,用real-time PCR法检测移植细胞存活率,免疫组织化学法检测新生血管密度和心肌细胞凋亡率,Western blot法分析VEGF和磷酸化Akt表达。 结果:细胞移植3周后,在4组中,经1.0μg/ml LPS预处理的野生型MSCs移植组(LPS-wMSCs移植组)较其余各组LVDd、LVDs均显著减少(P0.01),而LVEF和FS则显著增加(P0.01)。与其余3组相比,LPS-wMSCs移植组心肌纤维化显著减少(6.6±0.5%,P0.05),心肌细胞凋亡显著减少(14.8±1.5%,P0.01),新生血管密度显著增多(45.3±4.3,P0.01)。移植细胞的存活率在LPS-wMSCs移植组也显著增加(为wMSCs组的1.89±0.10倍,P0.01)。心肌组织内VEGF和磷酸化Akt表达在LPS-w MSCs移植组也增加。 结论:LPS预处理能够增加移植MSCs的存活率,促进VEGF的表达,激活PI3K/Akt信号通路。MSCs在移植之前经过LPS预处理后能够更好的改善心脏功能,增加新生血管密度。LPS的预处理能够作为增强MSCs生物学功能的一种新的手段。


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