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小鼠子宫内膜边缘群干/祖细胞的研究

胡菲菲  
【摘要】: 子宫内膜是具有高度增殖活性的组织。在人正常月经周期中,子宫内膜受卵巢性激素影响而发生周期性的再生、分化和剥脱;子宫内膜的再生可发生于分娩后及内膜刮除术后;用雌激素替代治疗的绝经后妇女子宫内膜亦具有极强的再生能力。在没有月经周期的物种,其子宫内膜随激素水平变化发生周期性的增殖与凋亡。早年即有学者提出子宫内膜干细胞假说,认为位于子宫内膜基底层的干细胞参与子宫内膜功能层的增生修复。多年的临床观察和基础研究证实这一假说。近年众多学者提出,子宫内膜干细胞可能含有上皮和基质两种类型的干细胞;子宫内膜干细胞数量、功能、调控和定位机制的改变可能参与了内膜增生异常相关疾病的发生与发展,这些研究才刚起步。最近,有学者应用边缘群(Side population, SP)细胞的分选原理从人的子宫内膜中分离出了干/祖细胞群。但是,受人子宫内膜材料来源和伦理学的限制,许多人子宫内膜功能性研究、相关人子宫内膜干/祖细胞生物学研究和应用研究仍难以进展。小鼠广泛应用于各种人体生理及病理模型研究,建立小鼠子宫内膜SP细胞分选方法、阐明小鼠子宫内膜干/祖细胞的功能及生物学特性,将有助于进一步明确干/祖细胞在子宫内膜再生过程中的作用及其机制,为人类相关生理与病理机制的研究提供参考,也为新药研究提供了实验材料。 本研究应用SP细胞的分选原理,从成年小鼠的子宫内膜中分选SP细胞,鉴定其干/祖细胞特性、体外培养,探讨性激素对子宫内膜SP细胞的作用,为今后进一步研究子宫内膜干细胞的功能特性,参与子宫内膜再生修复的机制及研究人类子宫内膜相关疾病提供研究模型。研究方法包括:(1)应用酶消化和机械分离结合的方法与机械研磨分离的方法制备小鼠原代子宫内膜细胞悬液,通过Hoechst33342-SP法,使用流式细胞仪分选小鼠子宫内膜SP细胞。(2)测定SP细胞CD34,CD45,CD105,SCA-1及c-Kit等干细胞表面标记物的表达情况;采用免疫荧光技术测定其细胞组分。(3)通过细胞周期分析及细胞克隆形成实验鉴定其干细胞功能特性。(4)测定SP细胞表型相关基因BCRP1/ABCG2的表达,并采用免疫荧光技术对SP细胞进行定位。(5)探讨雌激素对体外培养的SP细胞生长分化的作用。 结果:(1)采用酶消化和机械分离结合的方法与机械研磨分离的方法制备小鼠原代子宫内膜细胞悬液,两种方法均可获得足够数量的单细胞悬液用于SP细胞检测。机械研磨法获得的细胞悬液染色后无法测得SP细胞,并且细胞碎片多,不适用于分选SP细胞;酶消化和机械分离结合的方法制备的细胞悬液可稳定测得SP细胞,碎片少,适用于分选SP细胞。 (2)采用Hoechst33342-SP法无法从正常动情周期小鼠子宫内膜中分离SP细胞,而在产后小鼠子宫内膜可以稳定获得SP细胞。将纯系ICR小鼠与GFP荧光小鼠合笼后测定其产后子宫内膜SP细胞的GFP荧光表达情况发现,SP细胞不表达GFP荧光,SP细胞是来自母体子宫的原位组织细胞,不是来自胎儿组织的残留细胞。 (3)SP细胞的含量呈现一定的时间变化趋势。在产后第一天即可测得0.88±0.54%SP细胞,之后含量逐渐升高,在产后第17.5天的含量达到高峰,为13.95±3.42%。随后,SP含量逐渐下降,在产后第60天基本无法测得独立的SP细胞群。 (4)SP细胞群具有不均一性,通过测定上皮细胞及间质细胞标记分子CK-18和Vimenin的表达发现,SP细胞以间质细胞(90.82±1.83%)为主,7.83±2.27%的SP细胞表达CK-18,少数(9.23±3.08%)SP细胞表达αSMA,为肌性细胞。 (5)SP细胞来自母体子宫,大部分细胞不表达骨髓干细胞、间充质干细胞的表面标记物。SP细胞中,11.75±2.39%表达CD34, 8.95±5.51%表达CD45;4.27±1.30%表达CD44,2.64±0.48%表达CD105。SP细胞不表达内皮祖细胞的分子标记物CD31。SP细胞表达干细胞标记分子,是以间质细胞为主的不均一干/祖细胞群。2.57±1.67%的SP细胞表达c-kit,Sca-1+细胞含量达41.71±15.05%。 (6)SP细胞具有一定的干细胞生物学特性。SP细胞主要位于细胞周期静息期,G0/G1期细胞比例达86.34±5.73%, 13.15±5.44%的SP细胞处于G2期,0.5±0.34%的细胞处于S期。细胞克隆形成实验的结果表明,SP细胞可以进行体外培养,低密度接种条件下,克隆形成率显著高于非SP细胞,即MP(mian population)细胞:以300个细胞/cm2密度接种时,SP细胞的克隆形成率为0.37±0.06%,MP细胞的克隆形成率为0.14±0.05%(n=11,p0.01)。在500个细胞/cm2接种条件下时,SP细胞的克隆形成率为0.52±0.13%,MP细胞的克隆形成率为0.12±0.02%(n=11,p0.01),差异均具有统计学意义。SP细胞表达其表型相关标记分子BCRP1/ABCG2,主要定位于子宫内膜间质区域的间质细胞、血管内皮细胞及极少数腺上皮细胞。 (7)SP细胞接种于小鼠肾包膜下的体内实验显示,SP细胞具有在体生长分化的能力,在肾包膜下可增殖分化形成类似子宫内膜样的组织,具有体内增殖与分化的干细胞特性。 (8)SP细胞表达雌激素受体,受体内雌激素的调节。新鲜分离所得的SP细胞中,75.18±5.47%表达雌激素受体α;SP细胞雌激素受体的表达量显著高于MP细胞;Real-timePCR及Western Blot的结果表明产后子宫内膜雌激素及其受体的表达量变化趋势与SP细胞含量的变化类似,但是表达高峰在产后第14天,产后第17.5天表达量亦较高,但低于第14天的表达量;免疫组化结果显示产后小鼠子宫内膜中雌激素受体主要分布趋势与Real-time及Western Blot的结果相符合。产后第1及第3天表达雌激素受体的细胞很少,主要分布于腔上皮下的少量间质细胞,产后第7天起,雌激素受体表达量升高,表达雌激素受体的细胞主要分布于子宫内膜间质区,表达于间质细胞、腺上皮细胞及少量血管内皮细胞。 (9)雌二醇通过经典途径,对SP细胞具有促增殖和促分化两方面的作用。高浓度雌二醇作用后促增殖效应更明显,而接近生理浓度的雌二醇作用后促分化的作用更为显著。体外培养的条件下,10-6,10-7,10-8M三种浓度的雌二醇均可促进SP细胞的增殖,加入抑制剂ICI182780后,雌二醇对SP细胞的促增殖作用可被其阻断,10-6M浓度的雌二醇促增殖作用显著;雌二醇作用于SP细胞克隆形成实验结果显示,10-6,10-7,10-8M三种浓度的雌二醇作用后,SP细胞的克隆形成率分别为0.24±0.07%、0.19±0.06%和0.21±0.04%,大克隆形成率为0.07±0.05%、0.04±0.03%和0.02±0.01%,较对照组均呈下降趋势,其作用可被ICI抑制;但是,随着雌二醇浓度的增加SP细胞大克隆数又呈现递增趋势。 结论:(1)本研究利用Hoechst33342-SP原理,成功建立采用酶消化和机械分离结合法制备小鼠子宫内膜单细胞悬液、从产后小鼠子宫内膜获得SP细胞的方法,为进一步研究SP细胞的特性奠定了方法学基础;此SP细胞群为不均一干/祖细胞群,以间质细胞为主要组成部分,含有少量的上皮细胞和肌性细胞; SP细胞在正常动情周期中无法测得,在产后一定时间段内的内膜中可测得,含量随时间的变化先升高,后降低至无法测得;(2)SP细胞生物学和干细胞性质表明,SP细胞是来自子宫内膜原位组织的干/祖细胞群,表达干细胞标记物,具有体外形成细胞克隆的干细胞特性,是小鼠子宫内膜成体干细胞候选细胞,可用于进一步研究其参与内膜再生的调控机制;(3)SP细胞受雌激素的调节,表明性激素能够调控子宫内膜干/祖细胞增殖与分化,参与内膜组织的重建。 本研究发现小鼠子宫内膜与人的子宫内膜一样,含有SP干/组细胞群,在雌激素的作用下发生增殖分化,参与内膜的再生修复。进一步研究此小鼠子宫内膜干细胞的功能及相关机制,可为人类子宫内膜干细胞参与生理甚至病理性内膜再生相关机制的研究提供参考,为子宫内膜增殖异常相关疾病的治疗提供新的切入点。


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