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抗GP73、HDGF抗体的制备、夹心ELISA法的建立及临床初步应用

张爱霞  
【摘要】:肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率性疾病,早期发现和正确的诊断对肿瘤的预后往往起着决定性作用。肿瘤标志物的免疫学检测是肿瘤诊断的常用方法之一,对于恶性肿瘤的诊断、疗效的观察、病情进展的判断和复发的监测等有着十分重要的临床应用价值。越来越多的研究表明高尔基蛋白73(Golgi protein73,GP73)和肝癌衍生生长因子(hepatoma-derived growth factor,HDGF)均有可能成为有着良好应用前景的新型肿瘤标志物。为了获得用于GP73和HDGF的免疫病理学和免疫血清学检测的高特异性抗体,并建立可定量检测临床血清样本中GP73和HDGF的双抗体夹心酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),开展了如下研究: 首先,采用RT-PCR的方法从人肝癌组织中克隆并扩增出了人GP73和HDGF编码区片段,构建了原核表达载体。通过表达条件的优化使目的蛋白高效表达,并且采用亲和层析技术成功地分离纯化出高纯度的重组人GST-HDGF与His-GP73蛋白。Western和质谱的结果证实了目的蛋白的正确性。 在获得上述两种重组蛋白后,分别以其为抗原免疫新西兰白兔,制备并纯化出了高效价、特异性的抗GP73和抗HDGF多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb)。以天然的和经SDS变性后的重组His-GP73蛋白或GST-HDGF融合蛋白混合作为抗原免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备出了抗GP73与抗HDGF单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb),分别命名为GP73-6A2 mAb、HDGF-2F12 mAb。通过Western blot、免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)、免疫荧光(Immunofluorescent, IF)和免疫组化(immunohistochemistry, IHC)等多种实验方法,不仅证实这两株单抗具有特异性高、定位准确并且可以与天然的GP73和HDGF蛋白相结合的特点,而且可用于上述所有的免疫学检测。 为了能够定量分析血清中的GP73和HDGF含量,以GP73-6A2 mAb和HDGF-2F12 mAb为捕获抗体、抗GP73和抗HDGF pAb为检测抗体,成功建立了GP73和HDGF定量测定的双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA)法。GP73标准曲线上具有良好线性关系的检测区间为0.25~4 ng/ml,最低检测限为0.123 ng/ml;HDGF的线性检测区间为0.5~16 ng/ml,最低检测限为0.193 ng/ml。多次重复实验证实这两个检测系统具有良好的稳定性和重复性。通过对正常人、肝癌及肺癌血清样本中GP73及HDGF的测定对这两个检测系统在临床中的应用进行了初步验证。结果显示不仅肝癌病人血清中GP73的含量(1.72±1.089 ng/ml)明显高于正常人(0.613±0.179 ng/ml, p = 0.0036),而且首次发现肺癌病人(1.067±0.469 ng/ml)与正常人血清中GP73的含量也存在着显著性差异(p = 0.0245)。采用我们建立的双抗体夹心ELISA测得肺癌病人血清中HDGF含量为9.43±6.13 ng/ml,与正常健康志愿者血清HDGF含量4.36±2.50 ng/ml相比有着显著性差异(p = 1.12E-10)。 此外,通过细胞芯片的免疫组化结果我们还发现在一些还未见报道的肿瘤如:恶性胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、平滑肌肉瘤中,也存在着HDGF过表达的现象。这一结果从另一个侧面说明了HDGF可能是一个广谱的肿瘤诊断及预后的标志物。 综上,本研究采用基因工程技术表达纯化了高纯度重组人GP73和HDGF蛋白,以此为抗原制备了抗GP73和抗HDGF mAb与pAb。通过一系列鉴定实验证实所制备抗GP73和抗HDGF单抗可以用于如WB、IHC、IP、IF及ELISA检测。以mAb和pAb配对建立了用于临床血清样本中GP73和HDGF含量测定的双抗体夹心ELISA检测法,通过对正常人、肝癌、肺癌血清的测定对这两个检测系统进行了验证。结果表明肝癌和肺癌血清中GP73含量明显高于正常人,而肺癌与正常人血清中HDGF含量则有着显著性差异。上述定量检测证实了这两个检测系统在临床血清样本GP73与HDGF定量测定中的可行性,并且为后续的GP73和HDGF在肿瘤的诊断和预后中应用价值的大样本验证及相关检测试剂盒的研发奠定了坚实基础。


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