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~(125)I标记抗EGFR全人源Fab及其在肿瘤分子影像中的应用

许宁  
【摘要】:表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR; ErbB1)在多种实体肿瘤内有过表达。EGFR过表达的肿瘤恶性度较高、预后差、对化疗和放疗反应性差,同时病人生存率低。因此近年来,EGFR已成为肿瘤靶向治疗的理想靶标。作为个体化疗法,用药之前需要判断病人肿瘤内的EGFR表达水平,目前最常用的检测方法为免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC),此法已在临床上被用于EGFR靶向治疗前常规的病人筛选。然而,多份临床试验表明,免疫组化法不能正确的反映EGFR的表达水平。这主要是由于免疫组化法缺乏标准化系统,导致了试验结果的重复性差。同时,免疫组化法还是一种侵入性检测方法,限制了检测的次数。 分子影像学近些年得到了较快的发展。配合单光子发射计算机断层扫描显像(SPECT),将125~I等同位素偶联抗体分子,在体内综合提供每一个病人分子水平及生理水平的变化信息,不仅可以显示肿瘤的确切部位,并实现可视化某一特定分子的表达水平及活性,帮助了解肿瘤的生物学行为以及评价病人对靶向治疗的反应。. 本试验的前期研究中,已经从全人源天然Fab抗体库中筛选出了一株针对EGFR的全人源Fab抗体片段,并成功构建了表达载体。为了能够将此Fab片段作为靶向载体,偶联同位素后实现肿瘤的体内分子影像学诊断,本课题设计并完成了以下内容: 1.大量表达并纯化抗EGFR全人源Fab抗体片段 2.筛选表达不同EGFR水平的人肿瘤细胞株并建立动物模型 3.鉴定抗EGFR Fab片段对天然构象EGFR的特异性结合能力 4.放射性同位素125~I偶联Fab片段,并鉴定125~I-Fab活性 5~.动物模型体内验证125~I-Fab的诊断效能 研究方法: 1.本室构建的抗EGFR全人源Fab的pComb3X表达载体转染大肠杆菌Top 10F’并大量表达,经镍柱亲和层析法以及离子交换法两步纯化。2.分别用RT-PCR以及Western blot在mRNA和蛋白水平对6种人恶性肿瘤细胞株的EGFR表达水平进行评价,筛选出EGFR高、中、低三种表达水平的细胞株。 3.采用免疫沉淀(IP)和细胞免疫荧光分选(FACS)的方法,验证Fab是否能识别、区分活细胞表面不同表达水平天然构象的EGFR分子。 4.用氯胺-T法将放射性同位素125~I与Fab偶联,并用ELISA法和γ计数法验证偶联后Fab的特异性及抗原结合能力。 5~.在裸鼠体内建立EGFR高、中、低不同表达水平肿瘤细胞株的动物模型。 6.将约300μCi 125~I-Fab通过尾静脉注射入封闭甲状腺的动物模型体内,分别在注射后的3 d内多个时间点对裸鼠进行全身SPECT显像。 7.将注射后采集的图象进行感兴趣区(ROI)分析。 研究结果: 1.大量表达纯化抗EGFR全人源Fab蛋白,共20 mg,纯度达到95~ %以上。 2.筛选出A431,U118和M14三株人恶性肿瘤细胞,分别代表EGFR的高、中、低表达水平,并在裸鼠体内成功建立相应肿瘤模型。 3.成功将125~I和Fab偶联,标记率约为60 %,放化纯为97.82%。标记后的Fab仍然可以特异结合EGFR,并识别其在活细胞表面的天然构象。 4. 125~I-Fab成功显像高、中度表达EGFR的A431和U118模型,而不特异性结合低表达的M14模型。经ROI分析,125~I-Fab还可以区分EGFR在肿瘤组织中不同的表达水平。 结论: 本研究成功构建了放射性同位素125~I标记的抗EGFR全人源Fab偶联示踪剂,经体内试验证实,125~I-Fab可特异性显像EGFR高、中度表达的肿瘤组织,并可区分不同的表达水平,表明该125~I-Fab非常适用于EGFR过表达肿瘤的体内诊断,并可用于筛选接受相应靶向治疗的肿瘤病人和治疗后的病情监测。


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