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黄芩苷干预UVB辐射后皮肤光损伤及microRNA表达谱的实验研究

周炳荣  
【摘要】:研究背景和目的 紫外线,尤其是波长为290-320nm的中波紫外线(ultraviolet B, UVB)可导致诸多光源性皮肤损伤,如红斑、水肿、皮肤色素沉着、异常增生、光老化、光化性角化病以及皮肤肿瘤等。 有研究显示,UVB辐射可引起皮肤细胞DNA损伤,产生光产物,主要为6-4光产物(6-4 photoproducts,(6-4)PPs)和环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimers, CPDs)。这类光产物被认为是造成光源性皮肤损伤的重要介质。光产物形成后,细胞内重要的应激反应之一是p53蛋白在多个位点发生磷酸化,导致其半衰期延长并在细胞核内积聚。P53蛋白的活化可上调核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)通路活性对光产物进行切除修复,可调节凋亡和抗凋亡通路活性并启动凋亡程序,使严重受损而不可逆转的细胞发生凋亡。如果光产物未能及时清除,将导致DNA中出现以C→T或CC→TT碱基置换为特征的突变,突变基因进一步被大量复制,最终将会导致肿瘤发生。 中药黄芩中的主要活性成分黄芩苷(Baicalin)有着广泛的生物学效应,如抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用。本研究课题组的前期工作已在体外实验中证实了黄芩苷有着多方面的抗光损伤作用。然而,是否黄芩苷可在体内外实验中减少因照射UVB而造成的光产物,继而减轻诸多光损伤表现,以及黄芩苷发挥抗光损伤作用的确切机制尚未见有报道。故本研究试图就上述问题做一探讨。 MicroRNAs (miRNAs)是一类长约21-25个核苷酸的非编码单链RNA分子,这种小RNA分子能以不完全互补方式与其靶mRNA 3’非翻译端的特定区域相互作用来抑制靶基因的表达。近年来的研究发现,处于调节机制上游的miRNA家族对于转录后水平有极强的调节能力,其表达与肿瘤发生等生命活动过程密切相关。最新研究发现,紫外线辐射可引起小鼠胚肺成纤维细胞miRNA表达谱发生显著变化。然而,目前尚无关于抗光损伤药物miRNA靶位点的研究报告,发现并寻找出光损伤的有效生物学标记以及抗光损伤药物的核酸靶位点,对理解光源性皮肤损伤的发生机制有着重要意义,并对开发防治紫外线损伤产品具有极其重要的价值。故本研究试图采用miRNA基因芯片和多种生物信息学工具,观察并分析紫外线照射后小鼠皮肤中miRNA表达谱的变化以及黄芩苷对之的影响。试图为确定紫外线光损伤以及黄芩苷发挥抗光损伤作用中发挥关键作用的上游核酸靶位点提供实验依据。 方法 使用30 mJ/cm2和180mJ/cm2UVB分别照射人皮肤成纤维细胞和小鼠背部皮肤,同时使用黄芩苷进行干预。随后,使用免疫斑点印迹技术及免疫组织化学法检测CPDs;免疫印迹法检测P53蛋白;TUNEL法检测凋亡细胞;组织化学染色法检测过氧化氢。采用Agilent小鼠miRNA基因芯片技术检测对照组、UVB组和黄芩苷+UVB组小鼠皮肤中差异表达的miRNA。根据筛选得到的差异miRNA列表,利用TargetScan、miRBase和PicTar等多种生物信息学软件,对miRNA和基因之间的调控关系进行搜索,搜索出每个差异表达miRNA调控的所有靶基因并使用基因本体学(GO,gene ontology)分析策略和生物学通路预测软件进一步分析并预测其主要调节靶位点的功能以及相关靶信号通路。 结果 1.黄芩苷对UVB辐射后人皮肤成纤维细胞光产物生成的影响UVB照射前,使用不同浓度的黄芩苷预处理人皮肤成纤维细胞可以剂量依赖性地减少CPDs的产量。与UVB照射组相比,辐射前经过黄芩苷预处理的细胞p53表达量明显减少。 2.黄芩苷对UVB辐射后小鼠皮肤光产物产生及清除的影响辐射前外用黄芩苷可以减少UVB辐射后1小时小鼠皮肤中CPDs的产量,并可加速24小时和48小时CPDs的清除,此外,与UVB辐射组相比,经黄芩苷预处理的小鼠表皮中p53蛋白表达量和凋亡率均明显下降。 3.黄芩苷对UVB辐射后小鼠皮肤光损伤的影响无论是UVB辐射前还是辐射后外用黄芩苷均明显减轻紫外线辐射造成的小鼠皮肤红斑、皮肤水肿、细胞增殖和炎症细胞浸润。外用黄芩苷还可减少因UVB辐射诱导的小鼠皮肤组织中过氧化氢和CPDs产量。 4.黄芩苷对UVB辐射后小鼠皮肤microRNA表达谱的影响与对照组小鼠相比,接受180mJ/cm2UVB辐射的小鼠皮肤中miRNA上调基因3个,下调基因3个,差异表达miRNA的靶点与肿瘤侵袭、低甲基化、炎症因子合成以及凋亡等相关。与UVB辐射组小鼠相比,黄芩苷+UVB组小鼠皮肤中miRNA上调基因1个,下调基因3个,差异表达miRNA的靶点与DNA损伤修复通路等相关。 结论 本研究结果显示:UVB辐射前加入黄芩苷可以减少光产物的产生,有效地保护人成纤维细胞。黄芩苷还可以减少UVB辐射后小鼠皮肤中CPDs的产生,并加快CPDs的清除,其抗光损伤作用也反映在可减少小鼠皮肤中p53蛋白表达和细胞凋亡率。黄芩苷可抵抗UVB诱导的小鼠皮肤红斑反应,减少光产物表达,并通过减少炎症细胞浸润及活性氧簇的产生而发挥抗炎、抗氧化作用。本研究初步证实了黄芩苷调控的miRNA及其下游靶基因可能在抗光损伤方面中发挥一定作用,并且进一步的研究可能揭示光源性皮肤损伤发生发展中的上游分子机制,可为光源性皮肤损伤的防治提供全新靶位点。


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