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Aquaporin-4基因敲除对脑中CYP2E1表达及功能的影响

郝纯澍  
【摘要】:水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是一组广泛存在于动植物细胞膜上与水转运相关的整合蛋白,参与水分子的跨膜转运和细胞内外环境稳态的调节。迄今为止,在哺乳动物组织中已鉴定出13种水通道蛋白(AQP0-AQP12)。其中,水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)是中枢神经系统内最丰富的水通道蛋白,主要定位于神经血管单元中的星形胶质细胞以及室管膜上皮细胞,尤其富集于星形胶质细胞朝向血管面及软脑膜的胞膜区。此分布特点提示,AQP4在脑内内环境稳态及星形胶质细胞功能维持中发挥重要作用,可能是胶质细胞参与整个脑功能调节的重要结构基础。星形胶质细胞是脑中数量最多的神经细胞。其主要功能是维持脑内微环境的稳定;调节递质的合成、释放与代谢;分泌神经营养因子,促进神经再生,对神经元起到营养和支持作用等。研究发现,AQP4蛋白下调或缺失可导致神经元发育、增殖、迁移、修复等多项功能发生障碍,空间钾缓冲能力下降,细胞骨架蛋白结构异常。此外,AQP4还参与了小胶质细胞活化、血—脑屏障(blood-brainbarrierBBB)完整性调控等过程。已有资料表明,AQP4与脑水肿、脑损伤以及脑肿瘤的发生、发展密切相关。 细胞色素CYP450(cytochromeP450,CYP)是位于滑面内质网上的一组混合功能氧化酶系,是一组含亚铁血红素的酶,是肝脏代谢最主要的酶系之一,人类中确定的CYP450同功酶有20多种,CYP2E1是最主要的同功酶之一,又称为二甲基亚硝胺脱甲基酶,存在于细胞内质网、线粒体和游离微粒体的膜上,主要分布在成人肝脏,在其他肝外组织中也有表达,如肺,肾,脑中都有表达。脑中的CYP2E1主要分布在神经元、胶质细胞和内皮细胞中。CYP2E1在解毒和代谢过程中具有重要作用。对乙醇、亚硝胺等毒性物质具有特异性的代谢作用。CYP2E1在对乙醇等底物的代谢过程中可产生大量的ROS,使DNA、蛋白质和脂质氧化,造成细胞多种成分的广泛氧化损伤。脑中CYP2E1的调节机制还不很明确,但是已经有研究发现炎症可以引起CYP2E1的表达增加,进而引起氧化应激的产生。同时也有报道证明CYP2E1在MPTP造成的帕金森病模型中也发挥了重要的作用,但其具体机制还不清楚。 氧化应激是指活性氧族(reactiveoxygenspesies)生成与抗氧化防御系统之间的不平衡状态,可在ROS生成超过抗氧化防御系统时或者在抗氧化剂活性降低时发生,氧化应激和许多神经退行性疾病密切相关。星形胶质细胞在脑内毒素的清除过程中发挥着重要作用,而且星形胶质细胞为神经元内谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-L-cysteinyglycine)的合成提供前体物质。因此神经退行性病变中,星形胶质细胞抗氧化能力下降及其发生的氧化应激损伤,都会加剧病程的发展。 本文工作首先在离体的胶质细胞中研究了MPTP的离子形式MPP+对CYP2E1表达的影响,然后又利用自行制备的AQP4敲除鼠研究AQP4基因对病理状态下CYP2E1表达及功能的影响,检测指标是ROS的生成量。研究结果不仅为帕金森病发病机制的阐明和治疗提供了药物代谢方面的证据,也揭示了AQP4对脑中药物及毒物代谢的影响,深化对AQP4生理和病理功能的认识,揭示了AQP4是星形胶质细胞代谢功能调节的重要靶点,为临床中枢神经系统的用药提供了新的思路。 目的:研究AQP4对LPS和MPP+引起的星形胶质细胞的CYP2E1表达及功能改变的影响。 方法:取出生后3d内AQP4+/+及AQP4-/-型CD1乳鼠,原代培养星形胶质细胞,细胞免疫荧光化学检测CYP2E1在星形胶质细胞的表达;MTT比色法检测细胞活力;RT-PCR及免疫细胞组化检测CYP2E1的表达变化,流式细胞术检测细胞ROS水平。 结果:1)在AQP4基因敲除的星形胶质细胞中,MPP+、LPS、乙醇引起的细胞活力下降和ROS的生成增加较野生型明显。2)CYP2E1与GFAP在星形胶质细胞中共表达。3)给予MPP+后,星形胶质细胞中的CYP2E1表达增加;AQP4基因缺失后MPP+、LPS、乙醇对星形胶质细胞中CYP2E1的诱导作用增强。4)在两种基因型小鼠的星形胶质细胞中,二烯丙基硫醚(DAS),一种CYP2E1的抑制剂,可以缓解或者全部逆转MPP+、LPS、乙醇引起的细胞活力下降和ROS的生成。 结论:MPP+可以诱导星形胶质细胞内CYP2E1的表达;AQP4基因敲除后,MPP+、LPS、乙醇引起的星形胶质细胞细胞活力的下降和ROS的生成增多部分或全部由CYP2E1表达增加所致。 本文工作的主要创新之处在于: 首次揭示MPP+对星形胶质细胞中CYP2E1的诱导作用以及AQP4缺失对CYP2E1表达及功能的影响,研究结果为认识AQP4与脑内药物与毒物代谢的研究积累学术与实验基础,并为神经系统的合理用药和个体化用药提供新的思路。


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