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砷致激素非依赖型乳腺癌细胞雌激素受体α再表达的机制

杜鹃  
【摘要】:乳腺癌是全世界妇女中发病率最高的恶性肿瘤。雌激素受体α(ERα)是乳腺癌响应内分泌治疗的标志物。约2/3乳腺癌患者其乳腺癌组织表达ERα,这些肿瘤细胞一般分化较好,生长转移缓慢,对抗内分泌治疗敏感,具有雌激素依赖性。但约1/3患者的乳腺癌组织无ERα表达,这些肿瘤分化差,生长分数高,临床预后不良,对抗内分泌治疗亦不敏感。且随着肿瘤的进展,原来ERα阳性的乳腺癌患者最终也会失去ERα的表达。因此,使ERα重新表达并恢复内分泌治疗的敏感性的新策略就显得尤为重要。ERα失表达的机理不甚清楚,可能与其启动子区CpG岛异常甲基化有关。近来有文献报道三氧化二砷的去甲基化的作用。这与三氧化二砷代谢过程中消耗甲基供体造成DNA甲基化过程中甲基供体的相对或绝对不足有关,也与其抑制DNA甲基化所需的甲基转移酶(DNMTs)有关。因此,三价砷可能通过上述途径使某些基因去甲基化而重新表达,但砷是否可使缺乏ERα的乳腺癌细胞重新表达以及其确切机制尚未见文献报导。 目的:本研究采用雌激素受体阴性乳腺癌细胞( MDA-MB-231细胞)为体外模型,用三价砷(三氧化二砷)诱导ERα再表达,探讨不同浓度三氧化二砷诱导MDA-MB-231细胞株ERα重新表达的可能性及其可能机制。为砷应用于临床,提高缺乏ERα的乳腺癌对内分泌治疗的敏感性提供理论依据。 方法:采用RT-PCR和Western blotting检测三氧化二砷对MDA-MB-231细胞中ERαmRNA和蛋白表达的影响;采用MTS实验(检测细胞增殖)、RT-PCR(检测ERα靶基因表达)和荧光素酶报告基因实验(检测ERα转录活性)检测重表达的ERα是否有功能;采用5mC-免疫荧光实验、甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐修饰-测序PCR(BSP)实验检测三氧化二砷对MDA-MB-231细胞基因组及ERα启动子区甲基化状态的影响;应用Western blotting检测三氧化二砷对甲基转移酶(DNMTs)以及MBD2表达的影响;最后用ChIP实验检测三氧化二砷对ERα启动子上共阻遏复合物成员DNMT1的影响。 结果:一定浓度的三氧化二砷能诱导ER阴性的乳腺癌细胞ERαmRNA和蛋白的重新表达,RT-PCR实验显示三氧化二砷在雌激素存在时能诱导ERα靶基因pS2、GREB1的表达;MTS和双荧光素酶报告基因实验显示三氧化二砷可以使原来不响应内分泌治疗的MDA-MB-231细胞对雌激素和ER拮抗剂四羟他莫西芬和ICI182,780变得敏感。提示三氧化二砷诱导的重表达的ERα是有功能的。5mC-免疫荧光实验、MSP和BSP实验显示三氧化二砷能引起MDA-MB-231乳腺癌细胞基因组和ERα启动子区部分脱甲基化。甲基供体SAM可以减少砷引起的ERα重表达和ERα启动子区脱甲基化的程度。Western blotting实验显示三氧化二砷抑制MDA-MB-231细胞DNMT1、DNMT3A蛋白的表达,同时诱导MBD2蛋白表达增强。ChIP实验显示三氧化二砷抑制了MDA-MB-231细胞中DNMT1蛋白与ERα启动子的结合。提示三氧化二砷是通过使ERα启动子区脱甲基而使沉默的ERα重新表达的,并恢复了ERα受体功能。 结论:一定浓度的三氧化二砷通过与DNA竞争甲基供体SAM、抑制DNMT1、DNMT3A蛋白表达、诱导去甲基化蛋白MBD2表达上升,同时抑制了共阻遏复合物DNMT1与ERα启动子的结合,共同引起ERα启动子区甲基化程度的降低,从而使高甲基化而沉默的ERα因去甲基化而重新表达,并恢复了对抗雌激素治疗的敏感性。


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