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"Ala"~(16)-aFGF(1-29)对小鼠慢传输型便秘的治疗作用研究

胡小丹  
【摘要】:背景: 慢传输型便秘(slow transit constipation, STC)是由胃肠传输功能障碍引起的顽固性便秘。现有的研究认为肠神经系统(enteric nervous system, ENS)、Cajal间质细胞(intestinal cell of Cajal, ICC )、胃肠激素等与STC的发生发展有密切关系。但由于STC的具体病因和发病机制仍未完全明确,其临床治疗主要依赖各种泻剂的使用而缺乏根本有效的治疗手段。酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)具有促进细胞生长、抑制细胞凋亡、营养和修复神经等功能,并有研究报道aFGF存在于结肠神经系统并发挥重要的作用,据此推测其可能对STC的肠道病变产生积极的影响。[Ala]~(16)-aFGF(1-29)与aFGF大分子具有相同的生物活性,且更具临床应用前景,因此探讨[Ala]~(16)-aFGF(1-29)对STC小鼠的作用可为临床上寻找治疗STC的新方法提供实验依据。 目的: 探讨皮下注射[Ala]~(16)-aFGF(1-29)对小鼠慢传输型便秘的治疗作用及可能的机制。 方法: 一、60只ICR小鼠随机分为模型组及对照组(均n=30),皮下注射盐酸吗啡2.5mg/kg/d,共45d,建立STC模型,对照组以等量生理盐水同样处理。观察小鼠粪便性状—依据Bristol Stool Form Scale(BSFS)判定,粪便性状为BSFS 1,2符合便秘症状,BSFS 4,5则为正常;实验第45d,分别随机取6只小鼠以炭末推进实验测肠道推进率,证实STC模型的建立。 二、实验第45 d,观察两组小鼠粪便性状、禁食24 h小鼠结肠残留粪便量及炭末推进实验测肠道推进率。免疫组化标记结肠组织中NSE(神经元特异性标记物)及Caspase-3(凋亡蛋白)阳性细胞;Western blot检测结肠组织中NSE表达量;双重免疫荧光同时标记NSE和Caspase-3,分析肠神经元凋亡情况。 三、验证模型成立后剩余的模型及对照组小鼠在各组内再次分组,分别为实验1组、实验2组、对照1组、对照2组,实验1组及实验2组分别予以皮下注射[Ala]~(16)-aFGF(1-29)(300μg/kg,每周2次,共8周)和等量的溶解液同等处理,以观察比较[Ala]~(16)-aFGF(1-29)对STC的治疗作用;对照1组及对照2组亦分别给予药物及等量的溶解液同等处理以排除实验中的非特异因素。[Ala]~(16)-aFGF(1-29)治疗8 w后,观察各组小鼠的粪便性状、记录禁食24 h小鼠结肠残留粪便量及炭末推进实验检测肠道推进率。免疫组化标记结肠组织中NSE及Caspase-3阳性细胞;Western blot检测结肠组织中NSE的表达量;双重免疫荧光同时标记NSE和Caspase-3,统计各组肠神经元凋亡情况。 结果: 一、实验第45 d,模型组小鼠粪便性状(BSFS 1,2)较对照组(BSFS 4,5)明显干硬;与对照组相比,模型组小鼠禁食24 h后结肠中残留的粪便数量明显增加(P0.05)、肠道推进率则显著减低(P0.01),证实小鼠STC模型成功建立。 二、实验第45 d,实验室检测结果 (一)、肠神经元主要分布于小鼠肠道肠肌间丛和粘膜下神经丛,以肌间神经丛为著;免疫组化及Western blot均显示模型组小鼠结肠组织中NSE的表达量较对照组明显降低(P0.05)。 (二)、免疫组化显示两组小鼠结肠肌间丛及粘膜下丛均有Caspase-3表达,模型组Caspase-3的表达量较对照组明显增加(P0.05);双重免疫荧光显示模型组凋亡肠神经元的面积较对照组显著增高(P0.05)。 三、[Ala]~(16)-aFGF(1-29)治疗8 w后,实验1组小鼠的粪便性状逐渐变为香肠样软便(BSFS 4,5),较实验2组(BSFS 1,2)明显好转;与实验2组相比,实验1组小鼠禁食24 h后结肠中残留的粪便量明显降低,肠道推进率则显著增加(均P0.05)。以上检测项目在实验1组与两对照组之间均无显著差异(均P0.05)。 四、[Ala]~(16)-aFGF(1-29)治疗8 w,实验室检测结果 (一)、肠神经元分布仍以小鼠肠道肌间丛和粘膜下神经丛为主;免疫组化及Western blot均表明实验1组小鼠结肠组织中NSE表达量较实验2组明显增加(P0.05),较对照两组稍低但无显著统计学意义(P0.05)。 (二)、免疫组化显示各组小鼠结肠肌间丛及粘膜下丛均有Caspase-3表达,实验1组Caspase-3的表达量较实验2明显减少(P0.05),与对照两组相比无明显差异(P0.05);双重免疫荧光显示实验1组小鼠凋亡肠神经元的面积较实验2组明显减低(P0.05),与两对照组之间无明显差异(P0.05)。 结论: 一、连续45天皮下注射适量的盐酸吗啡可成功建立结肠慢传输型便秘动物模型。 二、慢传输型便秘小鼠结肠组织中肠神经元数量减少;肠神经元凋亡增加可能是肠神经系统病变的机制之一。 三、皮下注射[Ala]~(16)-aFGF(1-29)可明显改善慢传输型便秘小鼠粪便性状及肠道动力。 四、[Ala]~(16)-aFGF(1-29)可能通过抑制肠神经元的凋亡改善慢传输型便秘小鼠的肠神经病变。


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